高血壓腦出血模型大鼠不同時(shí)間段腦損傷
程度與 NO 含量和 C9 表達(dá)的關(guān)系
徐 莉
( 武漢市中南干休所醫(yī)務(wù)室，湖北 武漢 430071)
摘要: 目的 研究高血壓腦出血模型大鼠不同時(shí)間段腦損傷程度與腦組織 NO 含量和 C9 表達(dá)的關(guān)系。方法采用膠原酶法制備腦出血動物模型，將 96 只大鼠隨機(jī)分為均等的 3 部分( 每部分 32 只) ，分別用于腦組織含水量測定、腦組織 NO 水平測定和 C9 表達(dá)檢測。每部分又隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組共 2 組 ，每組 16 只;每個(gè)小組 16 只大鼠再4個(gè)為一組，于造模后 2、12、24、72h 測各組大鼠腦組織含水量，腦組織 C9 表達(dá)，NO 含量。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組 24 ～ 72h 腦組織含水量明顯增多、腦組織 C9 表達(dá)增多、NO 含量減少。結(jié)論腦出血急性期的腦組織損傷程度與腦組織 NO 水平、腦組織 C9 表達(dá)有一定關(guān)系，臨床**中改善腦循環(huán)、減輕炎癥反應(yīng)非常重要。
關(guān)鍵詞: 高血壓腦出血; NO; C9
中圖分類號: Ｒ965. 1
文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A
文章編號: 2095-4646( 2014) 02-0103-03
近年來的研究表明腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后血腫四周存在明顯的炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在腦出血繼發(fā)性腦損傷中起著 十分重要的作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體系統(tǒng)在腦損傷炎癥反應(yīng)過程中起著重要作用［2］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同時(shí)間段高血壓腦出血大鼠腦組織含水量、腦組織 C9 表達(dá)和 NO 水平，以探討其與腦損傷程度的關(guān)系。
1 材料與方法
1． 1 實(shí)驗(yàn)材料
1． 1． 1 動物分組與造模
大鼠由湖北省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號:SCXK( 鄂) 2011 ～ 012; 分組: 將 96 只大鼠隨機(jī)分為均等的 3 部分( 每部分 32 只)，分別用于腦組織含水量測定、腦組織 NO 水平測定和 C9 表達(dá)檢測。每部分又隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組共 2 組，每組 16只; 每個(gè)小組 16 只大鼠再 4 個(gè)為一組，分別觀察術(shù)后 2h、12、24、72h 四個(gè)時(shí)間點(diǎn)各項(xiàng)指 標(biāo)，各組飼養(yǎng)條件相同。
高血壓模型及腦出血模型的制備是通過應(yīng)用 雙腎雙夾法來復(fù)制腎性高血壓大鼠( ＲHＲ)模型。 剔除飼養(yǎng)過程期間出現(xiàn)腦卒中癥狀和體征的大 鼠。雙腎雙夾術(shù)后 2 ～ 3 月體質(zhì)量300 ～ 350g /只 的高血壓大鼠參照 Ｒosenberg［3］ 的方法，術(shù)前禁 食，可自由飲水，大鼠用****( 0． 1ml /100g) 注 射液腹腔麻醉后俯臥位固定于立體定位儀上，據(jù)圖譜調(diào)整立體定位儀于注射點(diǎn)，頭皮正中常規(guī)**后矢狀位切開約 1． 5cm，暴露前囟點(diǎn)，用骨鉆鉆顱打孔( 直徑約 1mm) 后 ，用微量進(jìn)樣器吸取膠原酶 2μl 迅速插入鉆好的孔內(nèi)，進(jìn)針 5mm，注射時(shí)間不少于 15min，且留針 10min 后緩慢退針，鉆孔處用骨蠟封閉，局部**后，縫合皮膚。
1． 1． 2 藥品與儀器注射用尿激酶( 03290，南京南大藥業(yè)有限責(zé)任公司) ，配制成 200IU /L 的溶液; 兔抗大鼠 C9 **組化試劑盒( 上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司) ; NO試劑盒來自南京建成生物工程研究所。儀器: 大鼠腦立體定位儀，微量注射儀購于北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司; 電子天平( SAＲTOＲ2US，BP211D) ，德國生產(chǎn); 8021 離心機(jī)( 上海手術(shù)器械廠) ; 752 分光光度儀( 上海精密儀器儀表有限公司) ; 半自動**組化儀( 常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司) ; 計(jì)算機(jī)病理圖像管理系統(tǒng) 4． 10( 北航圖像中心) 。
1． 2 方法
分別于術(shù)后第 2、12、24 及 72h，用 10% 水合氯醛麻醉大鼠后，迅速取出全腦，并用濾紙吸干腦表面液體和血跡，一部分置于中性福爾馬林內(nèi)固定作 HE 染色和**組化染色。另一部分用于腦組織含水量測定。
1． 2． 1 腦組織含水量測定［4］
將樣本小塑料封口袋密閉，置 － 20 ℃ 冰箱內(nèi)5 ～ 10 min 微凍硬后取出，置于薄膜隔開的干冰上，用薄刀片切取離膠原酶注入點(diǎn) 4mm 以外的2mm 厚冠狀腦片，分離出血側(cè)皮質(zhì)及基底節(jié)，置濃硫酸處理過的稱量杯內(nèi)。用電子天平稱取濕重后，置小玻璃瓶中，再放入05℃ 烤箱內(nèi)烘烤 24 ～ 48h，直到稱重為恒重。根據(jù) Eliott 公式可以計(jì)算腦組織含水量( Water Content，WC) WC( % ) = ( 濕重 － 干重) ÷ 濕重 × 100%
1． 2． 2 腦組織 C9 表達(dá)測定分別于第 2、12、24、72h 手術(shù)，取腦組織，固定: C9 著色于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。采用兔抗大鼠C9 **組化試劑合，按試劑盒要求檢測。在**組化陽性細(xì)胞胞漿及胞膜可見棕黃色顆粒。緊貼血腫周圍但不包括血腫區(qū)切片，每張切片隨機(jī)取4 個(gè)不重復(fù)高倍視野( 400 倍) ，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野 下陽性細(xì)胞數(shù)。所有切片均在同等強(qiáng)度下、同等 放大倍數(shù)下分析，取每一時(shí)間點(diǎn)高倍視野下的陽 性細(xì)胞數(shù)平均數(shù)，結(jié)果用 x珋± s 表示。
1．2．3 NO 測定
分別于第 2、12、24、72h 手術(shù)，微凍硬后取出，置薄膜隔開的干冰上，分離出血側(cè)皮質(zhì)及基底節(jié)，4℃下用預(yù)冷的勻漿介質(zhì)制備成 10% 的腦勻漿置 3000r /min 離心 15min 后，取腦勻漿上清液，按硝 基還原酶法測定 NO 的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
1．3 統(tǒng)計(jì)方法
數(shù)據(jù)以 x珋± s 表示，SPSS 17． 0 統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié) 果
2．1大鼠腦組織含量變化從表 1 可見，與假手術(shù)組相比，ICH 組腦組織含水量從 2h 開始增加，12h 增加較為明顯( P ＜ 0. 05) ，24 ～ 72h 增加*明顯( P ＜ 0. 01) 。
2． 2 大鼠腦組織 C9 表達(dá)結(jié)果
腦出血后 2h 血腫周圍可見少量 C9 表達(dá)，陽 性細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞( P ＞ 0. 05) ，腦出血后 12h 增加明顯，24h 達(dá)到高峰( P ＜ 0． 01) ，主要為小膠 質(zhì)細(xì)胞和少量的神經(jīng)元細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞亦可 表達(dá)，一直持續(xù)到 72h。可見，腦出血后 24 ～ 72h， C9 的表達(dá)處于高峰，與假手術(shù)組比較有顯著性差 異。見表 2。
2． 3 大鼠腦組織中 NO 含量的結(jié)果 與假手術(shù)組比較，ICH 組大鼠 2h 腦組織 NO 含量已有下降，12h 已有顯著性差異( P ＜ 0． 05) ， 24 ～ 72h 處于低水平( P ＜ 0． 01) 。
3 討 論
在腦出血的病理發(fā)展過程中，腦組織繼發(fā)性 損傷是腦出血病情加重、預(yù)后**的重要因素［5］。 出血性腦損傷的炎性反應(yīng)，由白細(xì)胞粘附血管壁， 血-腦屏障遭破壞、炎性細(xì)胞侵入腦實(shí)質(zhì)等組成。腦出血時(shí)炎性因子表達(dá)增加，能增加腦水腫、血管 壁通透性。NO 是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的強(qiáng)有力 的血管舒張因子，可以直接作用于平滑肌細(xì)胞，通 過激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)的游離鈣水平降 低，平滑肌松弛。腦部血流是由內(nèi)皮衍生的 NO 調(diào)節(jié) 的，NO 還是紅細(xì)胞聚集性的重要影響因 素［6］。NO 可通過抑制白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附、阻 止血小板凝集和疏通組織灌注等限制缺血性腦損 傷［7］。本實(shí)驗(yàn)中與假手術(shù)組比較，ICH 組大鼠 2h 腦組織 NO 含量已有下降，12h 已有差異( P ＜ 0． 05) ，24 ～ 72h 處于較低水平( P ＜ 0． 01) ，說明腦出 血急性期 NO 下降是導(dǎo)致紅細(xì)胞聚集，進(jìn)而溶解 破裂、血腫形成的重要因素，因而**中改善微循 環(huán)是重要環(huán)節(jié)。腦出血后腦水腫主要分為血管源 性腦水腫和細(xì)胞毒性腦水腫，血管源性腦水腫常 發(fā)生于腦出血早期，它的形成原因主要有血管壁 通透性增加、血管損傷、血漿外滲及血腦屏障破 壞［8］。腦出血后補(bǔ)體級聯(lián)被激活，C9 表達(dá)增加， 補(bǔ)體 C9-C5b 組成膜攻擊復(fù)合物( MAC) ，MAC 是大分子復(fù)合物，可形成跨膜孔道使大分子物質(zhì)和 離子雙向流動，進(jìn)而攻擊神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞 和血腫內(nèi)的紅細(xì)胞，加劇 ICH 后腦損傷，MAC 也 可直接插入星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞，破 壞血腦屏障。實(shí)驗(yàn)表明腦出血后 24 ～ 72h，C9 的 表達(dá)處于高峰，說明在腦出血后腦水腫尤其在血 管源性腦水腫中補(bǔ)體系統(tǒng)對于其發(fā)展起著重要作用。