腦立體定位技術(shù)可以說是目前神經(jīng)科學(xué)研究中不可缺少的一個(gè)*基礎(chǔ)的技術(shù)手段。我甚至找不到一個(gè)做神經(jīng)科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)室可以不使用這種技術(shù)的。

我在碩士階段使用腦立體定位技術(shù)進(jìn)行過病毒注射、電極陣列埋置、導(dǎo)藥管埋置和光纖埋置等實(shí)驗(yàn)。后來了解過微型攝像頭埋置，現(xiàn)在讀博士了還了解到有透析探針埋置等……

我總結(jié)了一下，腦立體定位的目的大概有下面這么3種：

1. 注射：把什么東西注射到腦組織里面去；

2. 取材：從腦組織里取什么東西出來；

3. 記錄：通過向顱內(nèi)埋置細(xì)微裝置記錄腦內(nèi)各種光學(xué)或電學(xué)信號(hào)。

這是我目前接觸到以及了解到的與腦立體定位技術(shù)相關(guān)的3種類型的實(shí)驗(yàn)。

可以看出它們的本質(zhì)其實(shí)都是腦立體定位技術(shù)。它們的一般流程包括：

（1）確定坐標(biāo)：根據(jù)腦圖譜確定目標(biāo)腦區(qū)的三維坐標(biāo)；

（2）顱骨鉆孔：經(jīng)過顱骨平面調(diào)平后將目標(biāo)坐標(biāo)在X-Y軸平面上的顱骨上鉆孔；

（3）定位植入：然后根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒆⑸潆姌O、導(dǎo)管、探針、光纖、攝像頭等植入目標(biāo)腦區(qū)。

我們可以看出這些實(shí)驗(yàn)的基本步驟都是一樣的，唯壹不同的只是*后一步植入的物件不同罷了。因此今天這篇分享采用更常見的病毒注射實(shí)驗(yàn)來舉例。

1.根據(jù)腦圖譜確定定位坐標(biāo)

腦圖譜我提供兩個(gè)網(wǎng)站（當(dāng)然，網(wǎng)上也可以很輕松的下載到大小鼠的腦圖譜）：

大鼠腦立體定位圖譜：

http://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas/

小鼠腦立體定位圖譜：

http://labs.gaidi.ca/mouse-brain-atlas/

2.玻璃微電極制作與裝配

（1）制作

這一步只有病毒注射這樣的實(shí)驗(yàn)需要，其他實(shí)驗(yàn)是不需要的。不同的病毒注射工具對(duì)注射的準(zhǔn)確度以及對(duì)小鼠腦組織的損傷程度差異還是很大的，我碩士階段一直使用的就是下圖這種所謂的“微量注射器”。

這種工具因?yàn)閷?duì)腦組織損傷很大，現(xiàn)在已經(jīng)很少用到了。這里單獨(dú)介紹應(yīng)用更廣泛的“玻璃微電極”的制作。

它是使用下面這種微玻璃管通過電極拉制儀拉制而成

拉制的時(shí)候，先調(diào)好拉制儀的參數(shù)

裝好玻璃電極并關(guān)上蓋子拉制電極

拉制完成后，根據(jù)實(shí)際需要用顯微剪將電極**剪掉一部分，這樣就得到了兩根玻璃微電極。

我們實(shí)驗(yàn)室一個(gè)老師自制了一臺(tái)高速旋轉(zhuǎn)磨盤，可以將電極**磨成一個(gè)45~60°的楔面，這樣可以更利于電極插入腦組織，不易斷針。

局部放大圖如下

在專門的顯微鏡下可以觀察微電極針尖細(xì)節(jié)

每次可以多拉一些，放在一個(gè)培養(yǎng)皿中，用橡皮泥固定備用

（2）裝配

玻璃微電極裝在微量注射泵之前先用1ml的注射器吸取礦物油填充玻璃微電極（否則后面吸入病毒時(shí)，玻璃微電極尾端會(huì)有空氣，在注射的時(shí)候空氣被壓縮，導(dǎo)致病毒注射的量誤差嚴(yán)重）。

礦物油填滿后將玻璃微電極尾端接在注射泵針頭上即可

3.手術(shù)

（1）麻醉

這個(gè)在不同的實(shí)驗(yàn)室可能使用不同的***，就不多列舉了。我只說我認(rèn)為*好的麻醉方式——異氟烷霧化吸入麻醉。

整套系統(tǒng)如下

▲左圖為麻醉機(jī)主體部分和透明的預(yù)麻箱；中間圖為抽氣泵和吸收罐；右圖為制氧機(jī)

麻醉機(jī)打開之后，將小鼠先放入預(yù)麻箱，然后向預(yù)麻箱中丟入一根浸有異氟烷的棉簽，不到1min小鼠就進(jìn)入麻醉狀態(tài)。

預(yù)麻完成之后將小鼠固定在定位器適配器上，適配器的鼻夾其實(shí)就是一個(gè)連接在麻醉機(jī)上的麻醉面罩

這樣小鼠后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中就可以一直吸入麻醉，并可以根據(jù)小鼠手術(shù)過程中的呼吸狀態(tài)實(shí)時(shí)調(diào)整麻藥濃度和供氧速率等。

比如當(dāng)小鼠呼吸慢而深的時(shí)候，提示麻醉太深，需要減小麻藥濃度，增大供氧；而當(dāng)手術(shù)過程中小鼠會(huì)因?yàn)楦械教弁炊鴶[動(dòng)的時(shí)候，說明麻醉強(qiáng)度不夠，就需要增加麻藥濃度；理想的麻醉狀態(tài)是小鼠呼吸均勻、快而淺。

（2）頭部固定

小鼠預(yù)麻醉完成之后，將小鼠固定在定位器的適配器上：在彎鑷的輔助下將牙齒插入牙槽 → 順次將左右側(cè)耳釘從耳洞進(jìn)入插在下頜骨下方托住頭顱 → 固定耳釘 → 固定鼻夾（麻醉面罩）。

這個(gè)部分，我的經(jīng)驗(yàn)是先將兩側(cè)耳釘在中間對(duì)齊，然后對(duì)稱的后退約1~2mm，使得兩根耳釘**間隔2~4mm。這個(gè)時(shí)候?qū)⒆髠?cè)的耳釘固定下來，然后再將小鼠托在手上，將加熱板調(diào)低，用手托著將小鼠牙齒卡入牙槽，緊接著用鑷子夾住小鼠的左耳使耳釘進(jìn)入耳洞，用左手微微向上托起小鼠身體；再將右側(cè)耳釘插入耳洞，托起身體，調(diào)整右側(cè)耳釘?shù)目潭扰c左側(cè)相同，同時(shí)觀察小鼠呼吸狀態(tài)良好，小鼠顱骨處于耳釘上方，說明耳釘插入正確。*后將鼻夾（麻醉面罩）套在口鼻上固定，將加熱板上調(diào)至適當(dāng)位置。

（3）顱骨平面調(diào)平

頭部固定好后，用眼藥膏涂蓋小鼠雙眼，防止照明燈長(zhǎng)時(shí)間照射傷害小鼠眼睛，用眼科剪剪掉（或用剃刀剃掉）小鼠頭頂毛發(fā)，剪開頭皮，用棉簽擦掉顱骨表面組織，充分暴露出Bregma點(diǎn)。

裝配上微量注射泵，在顯微鏡下找到Bregma點(diǎn)，設(shè)為立體坐標(biāo)原點(diǎn)

調(diào)平時(shí)，按照前后Bregma點(diǎn)和Lambda點(diǎn)調(diào)平；左（AP 0, ML -2.0）和右（AP 0, ML +2.0）點(diǎn)調(diào)平。調(diào)平兩側(cè)的誤差不超過0.05mm。

（4）顱骨鉆孔與定位注射

顱骨調(diào)平后，再次將玻璃微電極調(diào)回原點(diǎn)，根據(jù)目標(biāo)腦區(qū)坐標(biāo)的AP和ML值，確定在顱骨平面的投影區(qū)域進(jìn)行鉆孔。鉆孔結(jié)束后使用1ml的注射器**（提前將**向楔面后彎折）小心挑破腦膜。

再次回到原點(diǎn)，重新定位微電極到目標(biāo)核團(tuán)在顱骨表面的投影區(qū)，然后根據(jù)DV值將微電極插入腦組織內(nèi)目標(biāo)區(qū)域。

Tips：

1.電極：拉制完成后不要剪得太短，因?yàn)橛薪?jīng)驗(yàn)的同學(xué)都知道，**越長(zhǎng)越細(xì)反而更柔軟、更不容易斷；

2.麻醉：建議采用異氟烷麻醉，使用麻醉機(jī)和制氧機(jī)；

3.坐標(biāo)：根據(jù)圖譜查出來的坐標(biāo)建議先使用臺(tái)盼藍(lán)這樣的染料在廢鼠上進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，不斷調(diào)整定位的坐標(biāo)；

4.手術(shù)：暴露Bregma點(diǎn)的時(shí)候不要使用雙氧水，實(shí)際上我不建議這個(gè)實(shí)驗(yàn)的任何地方使用雙氧水，因?yàn)殡p氧水可能殘留在顱骨上導(dǎo)致后期顱骨腐蝕，對(duì)于需要二次手術(shù)的實(shí)驗(yàn)來說，就是災(zāi)難。