中華中醫(yī)藥學(xué)刊

慢性應(yīng)激對(duì)2 型糖尿病大鼠HPA 軸紊亂及海馬損傷的影響

楊蕙1，王宇紅2，張秀麗2，尹玲桃1，孟盼2

( 1． 湖南中醫(yī)藥大學(xué)**附屬醫(yī)院，湖南長沙410007; 2． 湖南省中藥粉體與****省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長沙410007)

摘要: 目的: 探討慢性應(yīng)激對(duì)2 型糖尿病大鼠HPA 軸紊亂及海馬損傷的影響。方法: 采用高脂灌胃聯(lián)合尾

靜脈注射鏈脲佐菌素( STZ) 的方法制備2 型糖尿病動(dòng)物模型并隨機(jī)分為兩組: 一組給予慢性應(yīng)激3 周，另一組不進(jìn)行慢性應(yīng)激; 同時(shí)以空白對(duì)照組及慢性應(yīng)激組為對(duì)照。造模結(jié)束后，Morris 水迷宮測(cè)定動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力; ELISA 法測(cè)定血漿皮質(zhì)酮( COＲT) 、促腎上腺皮質(zhì)**( ACTH) 、促腎上腺皮質(zhì)**釋放**( CＲH) 水平; HE染色觀察海馬、下丘腦、垂體和腎上腺形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果: 與正常組比較，糖尿病組、慢性應(yīng)激組及糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期( EL) 延長，空間探索時(shí)間( SET) 縮短; 血漿COＲT、ACTH、CＲH 水平升高; 海馬、下丘腦、垂體和腎上腺形態(tài)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同程度的器質(zhì)性改變; 但是糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)變化程度具有顯著性意義( P ＜ 0． 05) 。結(jié)論: 慢性應(yīng)激可導(dǎo)致糖尿病大鼠HPA 軸紊亂及海馬損傷，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損可能與此有關(guān)。

關(guān)鍵詞: 2 型糖尿病; 慢性應(yīng)激; HPA 軸; 海馬

中圖分類號(hào): Ｒ － 332 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào): 1673-7717( 2014) 11-2660-04

糖尿病是一種體內(nèi)胰島素分泌**或相對(duì)不足，導(dǎo)致血糖過高，出現(xiàn)糖尿，進(jìn)而引起脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的**。2010 年世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，全世界約2.85 億糖尿病( diabetes mellitus，DM) 病人，比2007 年增加1.56 億，2030 年預(yù)計(jì)可達(dá)4. 39 億［1］。糖尿病已成為繼心腦血管病、癌癥之后的第三大殺手。糖尿病的病因及發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，至今尚未完全闡明［2］。近年來，在生物－ 心理－社會(huì)新的醫(yī)學(xué)模式下，糖尿病被認(rèn)為是與心理因素密切相關(guān)的心身**，但對(duì)心理應(yīng)激在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中所起的作用還沒有達(dá)到統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。隨著應(yīng)激對(duì)糖尿病影響研究的逐步深入，精神因素和應(yīng)激事件對(duì)糖尿病的影響也越來越為人們所重視［3］。研究表明，外界應(yīng)激主要通過影響機(jī)體***紊亂而加重糖尿病的病情。由于應(yīng)激可影響機(jī)體的**神經(jīng)系統(tǒng)，如海馬［4］，而**神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)***，尤其是HPA 軸具有調(diào)控作用［5］，因此推測(cè)，慢性應(yīng)激可通過影響機(jī)體海馬結(jié)構(gòu)與功能，致***紊亂，HPA軸亢進(jìn)，進(jìn)一步影響糖尿病的病程。本實(shí)驗(yàn)通過給予2 型糖尿病大鼠慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激，探討糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，HPA 軸***指標(biāo)及重要臟器的病理改變，為現(xiàn)代社會(huì)糖尿病的發(fā)**展提供新的研究思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1． 1 藥品與試劑

鏈脲佐菌素( STZ) 由索萊寶公司提供; 高脂乳劑組成:10% 膽固醇、0． 2% 丙硫氧嘧啶、20% 豬油、2% 膽酸鈉、20%吐溫－ 80、20%丙二醇、加蒸餾水至100 mL 配制而成。COＲT、ACTH、CＲH 試劑盒由ＲD 提供。

1． 2 實(shí)驗(yàn)儀器

DB001Morris 水迷宮，北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司; MK3 型酶標(biāo)儀，Thermo，美國; ET － 12P 組織脫水機(jī)，江西富華生物技術(shù)有限公司; ＲM223 切片機(jī)，德國萊卡;DVP －W7 顯微鏡圖像處理系統(tǒng)，南京長城信息系統(tǒng)公司。

1． 3 動(dòng)物模型的建立及分組

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠50 只， 180 ～ 200 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào): SCXK( 湘) 2009 －0004; 合格證號(hào): HNASLKJ20102728。除空白組及慢性應(yīng)激組以外，其余大鼠均以高脂乳劑10 mL/kg 連續(xù)灌胃14 d，每天1 次。末次灌胃高脂乳劑后，大鼠禁食不禁水24 h，一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素( STZ，溶于新鮮配制的0． 1mol /L，pH = 4． 5 枸櫞酸緩沖液中，4 ℃保存) 38 mg /kg，正常對(duì)照組1 次性尾靜脈注射0． 1 mol /L，pH = 4． 5 枸櫞酸緩沖液，注射體積為2 mL/kg。造模72 h 后，所有大鼠禁食不禁水7 h，測(cè)定空腹血糖，從中選取空腹血糖≥16． 00 mmol /L 的大鼠為2 型糖尿病模型。糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為2組，分別為糖尿病組，糖尿病加21 d 慢性應(yīng)激組，以正常組和慢性應(yīng)激組為對(duì)照，每組8 只。慢性應(yīng)激包括4 ℃冰水浴5 min， 45 ℃熱刺激5 min，傾籠45° 24 h，噪音8 h，晝夜

顛倒24 h，潮濕墊料( 200 mL/籠， 24 h) ，夾尾1 min。每天采用一種刺激，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)。造模結(jié)束后進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血測(cè)定血漿皮質(zhì)酮( COＲT) 、促腎上腺皮質(zhì)**( ACTH) 、促腎上腺皮質(zhì)**釋放**( CＲH) 水平，HE 染色觀察海馬、下丘腦、垂體和腎上腺形態(tài)學(xué)變化。

1． 4 指標(biāo)測(cè)定

1． 4． 1 Morris 水迷宮Morris 水迷宮被均分為A、B、C、D 4個(gè)象限。訓(xùn)練前，水迷宮內(nèi)盛自來水，加墨汁使水變漆黑，檢測(cè)前將平臺(tái)置于D 象限水面下2 cm，使其在實(shí)驗(yàn)光線下對(duì)大鼠不可見。所有實(shí)驗(yàn)均在9 ∶ 00 － 15 ∶ 00 之間進(jìn)行，且保持室內(nèi)安靜，物品放置及燈光狀態(tài)一致，水溫( 24 ± 1)℃。第1 ～ 4 d 定位航行實(shí)驗(yàn): 按逆時(shí)針方向分別從A、B、C、D 4 個(gè)象限將大鼠面向池壁放入水中，觀察并計(jì)時(shí)60 s，檢測(cè)前將平臺(tái)置于D 象限正中水面下2 cm。攝像系統(tǒng)記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期( evasive latency，EL) ，若60 s 內(nèi)還未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其至平臺(tái)，停留15s，逃避潛伏期記為60 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以4 d 的逃避潛伏期曲線反映大鼠的學(xué)習(xí)能力。第5 d 空間探索實(shí)驗(yàn): 撤除平臺(tái)，將大鼠從距原平臺(tái)*遠(yuǎn)的B 象限面向池壁放入水中，攝像系統(tǒng)記錄大鼠在60 s 內(nèi)各象限游泳時(shí)間，以在原平臺(tái)所在D 象限游泳時(shí)間即空間探索時(shí)間( space explorationtime，SET) 作為記憶成績(jī)。

1． 4． 2 血漿指標(biāo)測(cè)定10% 水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉下行腹主動(dòng)脈取血， 2500 r /min 離心15 min 取血漿保存于－ 80℃ 冰箱，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書測(cè)定血漿COＲT、ACTH、CＲH 含量。

1． 4． 3 組織病理學(xué)檢測(cè)大鼠取血后，摘取大腦，垂體，腎上腺，立刻經(jīng)4% 福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1． 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11． 0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較用方差分析，每組兩兩比較用q 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以珋x ± s 表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2． 1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)定位航行實(shí)驗(yàn)中，與正常組比較，糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠的逃避潛伏期均隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長而有不同程度的延長( P ＜ 0． 05) ; 當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第4 d，糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠較糖尿病組和慢性應(yīng)激組的逃避潛伏期顯著延長( P ＜ 0． 05) ，即學(xué)習(xí)能力*差?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，與正常組比較，糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病并發(fā)抑郁癥組的探索時(shí)間均有不同程度的縮短，其中慢性應(yīng)激組和糖尿病并發(fā)抑郁癥組時(shí)間縮短具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 05) 。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激或糖尿病均可在一定程度上導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損，但糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激后，大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力衰退*為明顯，結(jié)果見表1。

2． 2 血漿COＲT、ACTH、CＲH 含量測(cè)定與正常對(duì)照組比較，糖尿病和慢性應(yīng)激大鼠血漿COＲT、ACTH、CＲH 水平均顯著升高( P ＜ 0． 05) 。與糖尿病組和慢性應(yīng)激組比較，糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠血漿

COＲT、ACTH 水平顯著升高( P ＜ 0． 05) ，CＲH 水平僅稍有升高( P ＞ 0． 05) 。結(jié)果表明糖尿病大鼠體內(nèi)存在HPA 軸亢進(jìn)，**分泌紊亂的現(xiàn)象，慢性應(yīng)激會(huì)進(jìn)一步惡化HPA軸紊亂，結(jié)果見表2。

2． 3 大鼠海馬，下丘腦，垂體，腎上腺病理檢測(cè)

2． 3． 1 大鼠海馬形態(tài)學(xué)變化正常大鼠海馬椎體細(xì)胞正常排列，形態(tài)正常。糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠椎體細(xì)胞均可見不同程度的胞體固縮，深染及空泡變性，表明海馬細(xì)胞存在一定程度的損傷。其中糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組病變*為明顯，結(jié)果見插頁Ⅶ圖1。

2． 3． 2 大鼠下丘腦形態(tài)學(xué)變化正常對(duì)照組大鼠下丘腦細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞呈圓形，核/質(zhì)比例等形態(tài)正常。糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠神經(jīng)元胞體增大，部分出現(xiàn)空泡樣變性，提示下丘腦分泌處于亢進(jìn)狀態(tài)。其中糖尿病組與糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組病變程度相似，均大于慢性應(yīng)激組，結(jié)果見插頁Ⅶ圖2。

2． 3． 3 大鼠垂體形態(tài)學(xué)變化正常對(duì)照組大鼠垂體嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞分布均勻，分泌ACTH 的嗜堿性細(xì)胞分布均勻，形態(tài)正常。糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠垂體均出現(xiàn)不同程度的嗜堿性細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞體積增加，細(xì)胞核深染，竇狀****增多，提示腺垂體分泌處于亢進(jìn)狀態(tài)。其中糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組病變程度*為嚴(yán)重，結(jié)果見插頁Ⅶ圖3。

2． 3． 4 大鼠腎上腺形態(tài)學(xué)變化正常對(duì)照組大鼠腎上腺球狀帶和束狀帶分界清晰，分泌糖皮質(zhì)**的束狀帶細(xì)胞排列整齊。糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠腎上腺球狀帶和束狀帶分界模糊，束狀帶細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大，胞漿空泡增多，提示腎上腺分泌處于亢進(jìn)狀態(tài)。其中糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組束狀帶細(xì)胞病變*為嚴(yán)重，結(jié)果見插頁Ⅶ圖4。