A型肉毒**對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型鎮(zhèn)痛效果及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究（上）

馬文俊1 梁 英2，3

摘要

目的：評(píng)估A 型肉毒**(BTX-A)在骨性關(guān)節(jié)炎模型中的鎮(zhèn)痛效果及疼痛相關(guān)物質(zhì)在脊神經(jīng)節(jié)的變化，為其臨床**骨性關(guān)節(jié)炎疼痛提供科學(xué)的理論依據(jù)。

方法：SD 大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%木瓜蛋白酶溶液0.3ml 建立膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)的動(dòng)物模型。造模成功的大鼠于第2 天隨機(jī)分為2 組：BTX-A 組(n=10)：關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射5μl  BTX-A  0.1IU；WFI 組(n=10)：關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射5μl  注射用水；Sham 組(n=10)：非關(guān)節(jié)炎模型組。注射后第1、3、5 天后檢測(cè)疼痛行為學(xué)、熱痛閾，**組織化學(xué)檢測(cè)脊神經(jīng)節(jié)鈉離子通道1.8(Nav1.8)蛋白的表達(dá)。

結(jié)果：自發(fā)疼痛行為分析顯示大鼠骨性關(guān)節(jié)炎引起步態(tài)異常，與WFI 組相比，BTX-A 組的大鼠異常步態(tài)改善明顯，注射后5 天與1、3 天相比較，自發(fā)疼痛行為改善的愈明顯；BTX-A 組大鼠右足熱痛閾升高(P<0.05)，脊神經(jīng)節(jié)Nav1.8蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。

結(jié)論：關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射BTX-A 可能通過下調(diào)脊神經(jīng)節(jié)Nav1.8 蛋白的表達(dá)，減少**致敏，減輕關(guān)節(jié)疼痛，提高痛閾，從而起到鎮(zhèn)痛作用。

關(guān)鍵詞    A 型肉毒**；膝骨性關(guān)節(jié)炎；鈉離子通道1.8；熱痛閾；鎮(zhèn)痛

中圖分類號(hào)：R684        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A        文章編號(hào)：1001-1242(2017)-06-0649-05

DOI:10.3969/j.issn.1001-1242.2017.06.008

*基金項(xiàng)目：山西省課題基金（201301055）

1    山西醫(yī)科大學(xué)附屬**臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原，030001；2    山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山西大醫(yī)院；3    通訊作者作者簡介：馬文俊，男，碩士研究生，住院醫(yī)師；收稿日期：2015-04-06

    膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee  osteoarthritis，KOA)是以滑膜和關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破壞為主要病理改變的慢性退行性的關(guān)節(jié)**[1]，發(fā)病率高，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量。目前**骨性關(guān)節(jié)炎的方法很多，如口服止痛劑、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇**或玻璃酸鈉、關(guān)節(jié)鏡清創(chuàng)術(shù)及關(guān)節(jié)置換，存在****反應(yīng)[2]、效果持續(xù)時(shí)間不穩(wěn)定，或高手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)的代價(jià)[3]，因此急需**關(guān)節(jié)炎的**、有效的方法。

KOA 伴隨關(guān)節(jié)軟骨的損害及膝關(guān)節(jié)炎性介質(zhì)的釋放增加，這些外周傷害性刺激的不斷的輸入將調(diào)控脊髓的痛覺傳遞神經(jīng)元，通過痛覺過敏及**敏化機(jī)制，導(dǎo)致神經(jīng)元突觸的興奮性增加和痛閾下降。脊神經(jīng)節(jié)是疼痛信號(hào)傳導(dǎo)的**級(jí)神經(jīng)元，且Nav l.8 特異性表達(dá)在脊神經(jīng)節(jié)，激活其動(dòng)作電位可使痛覺上傳。KOA 突出表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛，其疼痛的主要機(jī)制之一是脊髓中疼痛傳導(dǎo)遞質(zhì)Nav l.8 的過度表達(dá)，使患者對(duì)疼痛的敏感度增高。研究表明，A 型肉毒**（botulinum toxix  type  A,  BTX-A）對(duì)神經(jīng)病理性疼痛具有較好的止痛作用，但對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的鎮(zhèn)痛效果和鎮(zhèn)痛機(jī)制，尤其脊髓水平鎮(zhèn)痛機(jī)制的研究尚缺乏相應(yīng)的報(bào)道。目前已有臨床研究觀察到對(duì)老年慢性KOA 患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射A型肉毒**有減輕疼痛的作用，延緩KOA 的進(jìn)展，但其鎮(zhèn)痛機(jī)制尚不明確，缺乏理論支持，故臨床應(yīng)用受到制約。本研究擬在大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型中，通過關(guān)節(jié)腔注射A 型肉毒**，觀察其對(duì)大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎的鎮(zhèn)痛效果，并觀察脊髓背角中鈉離子通道Nav l.8 的表達(dá)的變化， 從**敏化角度部分闡明其鎮(zhèn)痛機(jī)制，達(dá)到改善膝骨性關(guān)節(jié)炎疼痛及**其**有效方法的目的。

1 材料與方法

         1.1 材料

SD 大鼠，均為雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量(150±30)g， 購自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。木瓜蛋白酶，購自天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，試劑號(hào)9001-73- 4。注射用BTX-A，購自蘭州生物制品研究所，批號(hào)20140609。兔抗大鼠 Nav1.8、FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG 均購自太原市貝倍科貿(mào)有限公司；電動(dòng)跑步機(jī)購自北京東西儀科技有限公司；鼠爪熱輻射刺激測(cè)痛儀購自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司。

         1.2 方法

參照Panicker 等[4]的建模方法建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，固定大鼠使右膝關(guān)節(jié)屈曲90°，乙醇**并充分暴露，于臏韌帶外側(cè)0.2cm 凹陷處進(jìn)針，出現(xiàn)落空感，回抽無血液后注入4%木瓜蛋白酶溶液0.3ml，注射完畢后再次**且反復(fù)活動(dòng)膝關(guān)節(jié)。于第1、4、7 天分別進(jìn)行注射。自注射之日起每日上、下午分別驅(qū)趕動(dòng)物活動(dòng)兩次，每次10min，以使大鼠于規(guī)定時(shí)限內(nèi)運(yùn)動(dòng)不停歇為標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)7 日。

將SD 大鼠隨機(jī)分成3 組，每組10 只：其中兩組是骨性關(guān)節(jié)炎組，分別給予BTX-A 和WFI。BTX-A 組：用 30 號(hào)針頭穿刺 2.5mm，膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射 5μl 的 BTX-A  0.1  IU；WFI 組：膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射 5μl 注射用水；Sham 組為非關(guān)節(jié)炎大鼠。

          1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 行為學(xué)測(cè)試：自發(fā)疼痛行為步態(tài)分析：肉眼步態(tài)分析觀察大鼠在 17cm/s 的電動(dòng)跑步機(jī)上行走20s。在0—4 分之間半定量分析大鼠的步態(tài)。0 分： 大鼠拒絕在跑步機(jī)上行走；1 分：大鼠行走了規(guī)定時(shí)間的30%，步態(tài)表現(xiàn)為嚴(yán)重的不協(xié)調(diào)；2 分：大鼠行走了規(guī)定時(shí)間的60%，步態(tài)表現(xiàn)為中等的不協(xié)調(diào)；3分：大鼠行走了規(guī)定時(shí)間的90%，期間沒有觸碰間隔物、跳躍、張腿或拖后腿，步態(tài)表現(xiàn)為輕微的不協(xié)調(diào)； 4 分：大鼠行走完了規(guī)定時(shí)間，期間沒有觸碰間隔物、跳躍、張腿或拖后腿。

熱刺激撤足閾值(paw withdrawal latency PWTL)的測(cè)定：利用鼠爪熱輻射刺激測(cè)痛儀檢測(cè)大鼠后肢足跟部皮膚對(duì)熱刺激的反應(yīng)。測(cè)試前將大鼠放置于測(cè)痛儀的有機(jī)玻璃罩內(nèi)自由活動(dòng)約5min，測(cè)試時(shí)將熱輻射光源通過透明玻璃板輸出熱刺激并聚焦于大鼠后肢足掌部。調(diào)整好儀器刺激強(qiáng)度(IR= 72)，按下操作開始鍵，熱源啟動(dòng)并緩慢施加熱刺激，在大鼠鼠爪撤足的瞬間手動(dòng)記錄大鼠反應(yīng)時(shí)間，此時(shí)間即為大鼠足底部的熱刺激撤足潛伏期(**度達(dá)0.1s)，即熱痛閾。為避免長時(shí)間熱刺激造成組織損傷不宜熱刺激時(shí)間超過25s。以5min 的間隔對(duì)雙側(cè)后足各測(cè)3 次，3 次撤足潛伏期的均值為所得數(shù)據(jù)。

1.3.2 **熒光組織化學(xué)檢測(cè)：用10%水合氯醛(4 ml／kg)麻醉大鼠后，行4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流術(shù)固定，取出 L5 背根神經(jīng)節(jié)，4%多聚甲醛浸泡固定 24h(4℃)。組織經(jīng)乙醇梯度脫水，石蠟包埋，厚4μm 石蠟切片。切片晾干后，經(jīng)二甲苯脫蠟，各級(jí)乙醇至水洗，PBS 溶液沖洗，脊神經(jīng)節(jié)滴加Nav1.8 一抗后 4℃過夜；次日用 dH2O、磷酸鹽緩沖液(PBS) 各洗 5min，滴加羊抗兔FITC，室溫過夜(注意避光)，次日熒光顯微鏡觀察，在激發(fā)光波長為490nm、濾色光波長為520nm 條件下拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理， 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。同一組大鼠不同測(cè)試時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)用相關(guān)樣本參數(shù)檢驗(yàn)分析；采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，用t 檢驗(yàn)及方差分析對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行分析，P<0.05 為有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 膝骨性關(guān)節(jié)炎模型

在大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射 4% 木瓜蛋白酶溶液0.3ml，實(shí)驗(yàn)第5 天80%大鼠已有不同程度出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹及活動(dòng)受限，7d 達(dá)到高峰。取20 只自發(fā)疼痛行為步態(tài)分析陽性(評(píng)分為1 分）及關(guān)節(jié)腫脹的大鼠。

2.2 自發(fā)疼痛檢測(cè)結(jié)果

自發(fā)疼痛檢測(cè)陽性的20 只大鼠分為兩組，在右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)分別注射BTX-A 組(n=10)：5μl 的BTX- A0.1  IU，WFI 組(n=10)：5μl 的注射用水，分別在注射后1 天、3 天及5 天進(jìn)行自發(fā)痛檢測(cè)。與WFI 組相比，BTX-A 組的大鼠自發(fā)疼痛行為改善明顯，差異有顯著性意義(P=0.002<0.05)。膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠在注射BTX-A 后1 天、3 天及5 天，分別進(jìn)行自發(fā)疼痛步態(tài)分析的檢測(cè)。注射BTX-A 后時(shí)間不同，自發(fā)疼痛行為改善也不同，差異有顯著性意義（P< 0.05）。注射BTX-A 后1、3、5 天，三組中兩兩相比較均有顯著性差異（P<0.05），且隨著注射后時(shí)間延長 (≤5 天），自發(fā)疼痛步態(tài)改善越明顯。

2.3 熱痛閾檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 三組大鼠：Sham 組、關(guān)節(jié)炎+WFI 組、關(guān)節(jié)炎+ BTX-A 組分別在注射后第1、3、5 天測(cè)試大鼠右足熱痛閾值。在實(shí)驗(yàn)觀察的時(shí)間內(nèi)，關(guān)節(jié)炎+WFI 組與Sham 組比較，PWTL 均有所降低（P<0.05，見表1)。

2.3.2 熱痛閾結(jié)果顯示：模型組大鼠第 1 天給予BTX-A 注射后24h 大鼠的熱痛閾值即明顯上升（P< 0.05，見圖1），且隨時(shí)間的延長其緩解疼痛效果逐漸明顯，一直可持續(xù)到注射后第5 天（P<0.05，見圖1），與注射用水組比較，BTX-A 組熱痛閾明顯高于對(duì)照組（P<0.05，見表1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射BTX-A 可緩解疼痛，增加熱痛閾值。

2.4 脊神經(jīng)節(jié)Nav1.8 的表達(dá)

**熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示W(wǎng)FI 組可上調(diào)DRG（背根神經(jīng)節(jié)）神經(jīng)元中Nav1.8 蛋白表達(dá)水平（見圖2），與假手術(shù)組比較，有顯著性意義（P<0.05， 見表 2）。BTX- A 注射 5 d 后大鼠 DRG 神經(jīng)元中Nav1.8 蛋白表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象被明顯抑制（見圖2），與注射用水組比較，具有顯著性意義（P＜0.05，見表 2）。結(jié)果提示BTX-A 干預(yù)后可下調(diào)大鼠DRG 神經(jīng)元中原本表達(dá)增多的Nav1.8 蛋白。