丙戊酸對顱腦損傷大鼠海馬成體神經干細胞原位激活的作用

楊偉鋒1 ，金保哲2 ，張新中2 ，王 磊1 ，周文科2 ，王仲偉2

( 1． 新鄉(xiāng)醫(yī)學院 2013 級碩士研究生，河南 新鄉(xiāng) 453003; 

2． 新鄉(xiāng)醫(yī)學院**附屬醫(yī)院神經外科，河南 衛(wèi)輝453100)

摘要:目的觀察丙戊酸( VPA) 對顱腦損傷后大鼠海馬成體神經干細胞( NSC) 原位激活的作用。方法將成年健康Sprague-Dawley 雄性大鼠 66 只隨機分為正常對照組( n = 6) 、單純損傷組( n = 30) 和VPA **組( n = 30) ，正常對照組大鼠不做任何處理，單純損傷組及 VPA  **組大鼠建立閉合性顱腦損傷模型;  VPA  **組大鼠按每天300   mg·kg －  1      的劑量經腹腔注射給藥進行干預，單純損傷組大鼠給予腹腔注射等量的生理鹽水進行干預，分別于顱腦損傷后  3、7、14、21、28    d   斷頭取腦標本，采用**熒光技術檢測各組大鼠不同時間點海馬齒狀回內   5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷( Edu) 陽性細胞數及大鼠海馬齒狀回內巢蛋白( Nestin)   陽性細胞數的變化。結果     單純損傷組和 VPA **組大鼠海馬齒狀回內 Edu 陽性細胞數及 Nestin 陽性細胞數于造模后第 3 天開始增高，于造模后第 21 天達高峰， 在同一時間點單純損傷組和 VPA **組大鼠 Edu 陽性細胞數及 Nestin 陽性細胞數均高于正常對照組( P ＜ 0． 01) ，而 VPA **組各時間點 Edu 陽性細胞數及 Nestin 陽性細胞數較單純損傷組明顯增加( P ＜ 0． 01) 。結論    丙戊酸對顱腦損傷大鼠海馬成體 NSC 有原位激活作用。

關鍵詞:創(chuàng)傷性顱腦損傷; 丙戊酸; 大鼠; 神經干細胞

中圖分類號:  Ｒ394． 2    文獻標志碼:  A    文章編號:  1004-7239( 2016) 06-0469-04

丙戊酸( valproic  acid，VPA) 是目前臨床一線廣譜抗癲癇藥，在預防和控制癲癇發(fā)作中發(fā)揮著主要 作用。VPA 是分子量很小的短鏈脂肪酸，由 8 個碳原子和脂肪酸支鏈組成，能很好地透過血腦屏障。近年來有研究表明，VPA 在**腦卒中、阿爾茨海默病、帕金森病等神經系統(tǒng)**中有顯著療效［1-4］。作者通過制作重型顱腦損傷大鼠模型，造模成功后給予 VPA 進行干預，于不同時間點取材測定顱腦損傷大鼠腦組織中 5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷( 5-e- thynyl-2'- deoxyuridine，Edu) 細胞及巢蛋白( Nestin)陽性細胞的表達及其動態(tài)變化，觀察 VPA 對顱腦損傷大鼠海馬成體神經干細胞( neural  stem  cell，NSC)的原位激活作用。

1 材料與方法

1． 1 實驗動物    健康清潔級成年 Sprague-Dawley ( SD) 雄性大鼠 66 只，體質量 250 ～ 300  g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號: SCXK ( 京 ) 2012-0001， 質 量 合 格 證 號 : 11400700108852。

1． 2主要試劑及儀器 鼠自由落體打擊器( 北京智鼠多寶生物科技有限公司) ，Edu 組織切片試劑盒  ( 美國 Gene  Copoeia 公司) ，VPA ( 北京百靈威科技有限公司) ，Nestin 單克隆抗體( 英國 Abcam 公司) ，羊抗鼠熒光二抗、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚( 4'，6- diamidino-2-phenylindole，DAPI)  染色反應液(  美國 Gene Copoeia 公司) ，BM-IX 型生物組織包埋機( 孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司) ，Shan Don Finesse 325型石蠟切片機( 美國 Thermo 公司) ，**熒光顯微鏡( ECLIPSE 55i，日本 Nikon) 。

1． 3動物分組及模型制備 健康清潔級成年 SD雄性大鼠 66 只，隨機分為正常對照組( n = 6) 、單純損傷組( n = 30) 和 VPA **組( n = 30) 。正常對照組大鼠不做任何處理; 單純損傷組、VPA **組大鼠以 Feeney 方法［5-6］制作顱腦損傷模型。將大鼠置于底座，固定頭部。質量分數 10% 水合氯醛麻醉， 剪去大鼠頂枕部毛發(fā)，常規(guī)**，在頂枕部的中線偏 右約 5 mm 處縱行切約 4 cm 切口，鈍性剝離軟組織和骨膜，充分暴露顱骨。在人字縫前 3 mm、顱骨中線旁 3 mm 處，鉆一直徑約 5 mm 的圓形骨孔，可見硬腦膜，注意保護其完整完好。大鼠自由落體打擊 器以 25 g 打擊錘從 20 cm 的高處自由落體打擊，造成大鼠閉合性顱腦損傷，成功后骨蠟封閉骨破損區(qū)， 縫合頭皮。術后 VPA **組大鼠給予腹腔注入VPA，按每天 300  mg·kg ^－ 1 的劑量經腹腔注射給藥，連續(xù)給藥至處死當天; 單純損傷組大鼠術后經腹腔給予等量的生理鹽水; 術后將大鼠分籠飼養(yǎng)在動物專用飼養(yǎng)室。

1． 4 造模大鼠行為學評分及入組標準 參照大鼠神經功能評分( neurological  severity  scores，NSS) ［7］于術后第 1、4、7、14、21、28 天對各組大鼠神經功能進行評分。包括運動、感覺、反射及平衡能力 4 項， *高 18 分，*低 0 分。輕度損害: 1 ～ 6 分，中度損害: 7 ～ 12 分，重度損害: 13 ～ 18 分。入組標準為術后第 1 天評分 5 ～ 15 分。

1． 5取材與制片 按分組給予 Edu 標記( 參照說明書) : 采用生理鹽水溶解 Edu 至 0． 5  g·L ^－ 1 ，按照 50  μg·kg ^－ 1 每只大鼠尾靜脈注射 20  μL，連續(xù)注射  2 d。將單純損傷組及 VPA **組大鼠分別在造模后第 3、7、14、21、28 d 分別取 6 只大鼠，質量分數10% 水 合 氯 醛 麻 醉，先 用 肝 素 化 生 理 鹽 水10 U·mL ^－ 1 快速灌注，然后換 40 g·L ^－ 1 多聚甲醛灌注，至 肢體抽搐，斷 頭取腦，沖 xi腦表面積血， 40 g·L ^－ 1 多聚甲醛固定過夜，以視交叉為中心向后取 2 mm 厚的冠狀腦片，充分固定后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，用石蠟切片機制作厚5 μm 冠狀切片，每個標本取 3 張片，行 Edu 及Nestin **熒光染色［8］。

1． 6 Edu 及 Nestin **熒光染色    采用 Edu 組織切片試劑盒進行 Apollo 染色，嚴格按照說明書進行操作，然后滴加 100 μL 1 × DAPI 染色反應液，避光，室溫孵育 30 min 后，棄染色反應液，無菌磷酸鹽緩沖液( phosphate buffered saline，PBS ) 清洗 1 ～ 3 次，洗脫 DAPI 反應液，檢測 Edu 陽性細胞。采用檸檬酸鹽抗原修復液進行抗原修復后，PBS 清洗 1 ～ 3次，山羊血清 37  ℃ 封閉 30 ～ 60  min，抗 Nestin 抗體 1∶50 稀釋成工作濃度后孵育一抗，37 ℃ 作用30  min，0． 01  mol · L ^－ 1 磷酸鹽吐溫緩沖液(  phos- phate  buffered  saline  with  tween-20，PBST) 緩沖液震蕩漂洗 3 次，每次 5 min ，加 1∶1 000 羊抗鼠熒光二抗，37  ℃ 濕盒避光作用 30 min，0． 01 mol·L ^－ 1 PBST避光漂洗 3 次，每次 5  min，甘油緩沖液封片。在顯微鏡上同一視野內分別用 488 nm 和 555 nm 波長進行激發(fā)檢測。熒光顯微鏡下觀察各組海馬區(qū)齒狀回 陽性細胞數，每只大鼠隨機選取海馬齒狀回區(qū)各 3 張切片，每張切片每高倍鏡下計數 5 個視野并拍照， 取其均值作為陽性細胞數［9］。

1. 7 統(tǒng)計學處理 應用 SPSS 19． 0 對數據進行處理，計量資料以均數 ± 標準差( x珋± s) 表示，采用析因的方差分析進行檢驗，組間比較用 LSD 檢驗方法， 檢驗水準 α = 0． 05。

2 結果

1 3 組大鼠腦組織齒狀回 Edu 陽性細胞比較結果見圖 1 和表 1。單純損傷組和VPA **組大鼠海馬齒狀回內Edu 陽性細胞數于造模后第3 天開始增高，于造模后第 21 天達高峰，在同一時間點單純損傷組和 VPA **組大鼠 Edu 陽性細胞數均高于正常對照組( P ＜ 0． 01) ; 而 VPA **組大鼠各時間點 Edu 陽性細胞數較單純損傷組明顯增加( P ＜ 0. 01) 。

2． 2 3 組大鼠腦組織齒狀回 Nestin 陽性細胞比較結果見圖 1 和表 1。單純損傷組和VPA **組大 鼠海馬齒狀回內 Nestin 陽性細胞數于造模后第 3 天開始增高，于造模后第 21 天達高峰，在同一時間點單純損傷組和 VPA **組 Nestin 陽性細胞均高于正常對照組( P ＜ 0． 01) ; 而 VPA **組大鼠各時間點 Nestin 陽性細胞數較單純損傷組明顯增加( P ＜ 0. 01) 。

3 討論

動物實驗研究證明，顱腦損傷后可誘導海馬齒 狀回等部位內源性 NSC 的分裂增殖，且多數可分化為成熟顆粒神經元［10-11］。但這種由創(chuàng)傷誘導的神經干****往往不能改善腦外傷所造成的損害。VPA 作為組蛋白去乙?；? histon deacetylaseHDAC) 抑制劑，對**神經系統(tǒng)損傷后局部炎癥反應有抑制作用 。近年來，有研究表明，無論在體外還是在體內，VPA 均具有保護細胞和抗細胞凋亡的作用［12］。

Edu 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶( T) 滲入正在復制的 DNA 分子中，通過基于 Edu 與 Apollo 熒光染料的特異性反應快速檢測細胞 DNA 復制活性，適用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA 修復、病毒復制、細

胞標記示蹤等方面的研究。與傳統(tǒng)的 5-溴脫氧尿嘧啶核苷相比，其分子量小，更容易穿過細胞膜，能 有效在組織間進行滲透，從而實現快速處理組織和 器官的切片標本，而且在檢測時不需要對標本進行 變性處理，不會出現因變性引起 DNA 結構改變，因此，有效保證了 DNA 結構的完整性［13-15］，增加了檢測的靈敏度和準確度。Nestin 屬于胚胎性第Ⅵ類中間絲蛋白，主要定位于細胞基質內，在**神經系統(tǒng) 發(fā)育中僅在胚胎期表達，出生后即停止表達［16-17］; 未分化和具有分裂能力的神經前體細胞內有豐富的Nestin 陽性表達，隨著其向神經元和神經膠質細胞的進一步分化，Nestin 的表達即逐漸降低，而被星形膠質細胞標志物即膠質纖維酸性蛋白、波形蛋白或 神經絲所替代。而顱腦損傷可引起成體腦內 NSC 增殖，表現為 Nestin 表達增高，所以多將 Nestin 用于鑒定損傷后**神經系統(tǒng)內 NSC 的增殖變化［16-17］。因此，本實驗以 Edu 和 Nestin 作為觀察指標來研究VPA 對大鼠顱腦損傷后海馬齒狀回 NSCs 增殖變化的影響。

本實驗應用 VPA 作用于顱腦損傷大鼠，于不同時間點觀察 Edu 及 Nestin 陽性細胞的表達情況。實驗結果顯示，應用該**后 Edu 及 Nestin 陽性細胞數與正常對照組及單純損傷組比較明顯增加; VPA **組大鼠 Edu 及 Nestin 陽性細胞數在應用VPA 3 d 后比單純損傷組稍有增加，之后增加漸趨明顯，至第 21  天達高峰，28  d 與 21  d 比較不再增加。從而說明 VPA 對顱腦損傷大鼠海馬成體 NSC 有原位激活作用，在顱腦損傷前 21 d 應用該藥對NSC 的激活作用明顯，之后作用逐漸減弱，這為臨床用藥時間窗的確定提供了參考依據。另外，從實驗 中也可以看到，顱腦損傷后不管是單純損傷組還是VPA **組，海馬齒狀回 Edu 及 Nestin 陽性細胞數均比正常對照組大鼠明顯增加，這說明顱腦損傷對 大鼠海馬成體 NSC 也有原位激活作用，而且 VPA 與顱腦損傷有協同作用，共同促進大鼠海馬成體NSC 原位激活的作用。但 VPA 促進 NSC 增殖的具體機制以及其動態(tài)遷移的過程尚不清楚，還有待于 進一步的系統(tǒng)研究。