實驗動物的灌注固定原理和技巧
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灌注固定主要用于神經(jīng)系統(tǒng)，其他組織意義不是很大，而且耗時耗力。對神經(jīng)系統(tǒng)防止變性效果較好！
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小鼠灌注：
灌流固定小鼠時我一般采用輸液器的針頭(4號半，這樣肉眼可見就是肺部明顯充氣脹大變白，針頭要從心軸方向進針，刺入心尖3~4毫米左右就可以了，開始灌流后剪破右心耳，約40毫升生理鹽水，后再灌流約20毫升多聚甲醛，整個灌流固定的過程就完成了。
大鼠灌注：
按大鼠體重，用2%****鈉（0.25ml/100g）進行腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，向左心室內(nèi)注射1%肝素鈉0.2ml后經(jīng)左心室行主動脈插管，血管鉗固定后剪開右心耳，先以生理鹽水150ml快速沖洗血管，然后用4%多聚甲醛的0.01mol/LPBS（4℃，PH7.40）250ml灌注固定，先快后慢，共需時間為50min，之后取材，置4%多聚甲醛固定液后固定，在4℃冰箱內(nèi)保存。多聚甲醛進入大鼠體內(nèi)，大鼠會出現(xiàn)四肢、尾的抽搐，*終 以肝臟發(fā)白、內(nèi)臟鼓起即灌注好。
腦組織**組化實驗
1. 灌注固定用的針頭，一般都用注射針頭。灌注大鼠一般可用10到12號針頭，小鼠可用6、7號針頭，但很重要的一點是要把針頭的**磨鈍而不是用銳利的針頭。（對不起老板了，把我們的秘密都外傳了）。
2. 關(guān)于穿刺：灌注大鼠時要把穿刺針的**插入到升主動脈內(nèi)，但不宜進入升主動脈過長，在動脈內(nèi)見到針頭或插入約1mm左右即可；灌注小鼠時只要把針頭插入左心室內(nèi)即可，不必要插入到升主動脈內(nèi)。操作的要點是：**，操作要迅速，剪開膈肌后，迅速沿腋前線剪開胸壁，并把胸前壁往上翻，暴露心臟；**，一定要在明視野下操作，要剪開心包壁層的前壁，暴露升主動脈和肺動脈干的根部，確保穿剌針能進入升主動脈；第三，穿刺之前要用適當大小的血管鉗夾住心室以固定心臟，但不要夾得過緊，要讓心腔內(nèi)留有一定的間隙，然后在心尖處輕輕旋轉(zhuǎn)針頭插入穿刺針。也可以用小剪刀在心尖處先剪開一個小口再插入穿刺針；第四，穿刺方向要正確，從心尖部開始，從左下方斜向右上方，若遇阻力要改變方向再試，不要用力蠻插。
3. 灌注用生理鹽水的量大鼠用50ml左右，小鼠用10ml左右，一般以從右心耳流出的液體清亮為標準；4%多聚甲醛用量約相當于老鼠體重，如300克的老鼠用300ml左右。小鼠一般用20-30ml。灌注速度先快后慢，可持續(xù)1-2個鐘頭，也可以稍快。取腦后置腦塊于4%多聚甲醛內(nèi)4度后固定4-6個鐘頭。
難點與關(guān)鍵點：
將灌注針插入主動脈內(nèi)是灌注固定的關(guān)鍵，也是難點。首先準確找到主動脈，這是此步驟的要點?？捎脺厣睇}水將胸腔內(nèi)的血液沖洗干凈，用眼科鑷子輕輕夾住心外膜（夾的越少越好，以免影響取材）將心臟向左上方提起，即可看清主動脈，又可使灌注針很容易地插入主動脈內(nèi)。插入時動作要慢，針尖方向不要偏向右側(cè)，以免刺入右心房，如果感到有阻力，則將針退后、調(diào)整方向重新進針，直到進入主動脈，灌注針進入主動脈后可在心臟的上方看到其位置，灌注針進入主動脈的長度*好為3~5毫米，然后用絲線扎緊。切勿將灌注針放在左心室內(nèi)，這樣由于主動脈瓣的關(guān)閉，灌注液很難進入主動脈，而是沿著心室的切口流出，致使灌注失敗。另 外，灌注針插入成功后，一定要用剪刀剪開右心耳而不是右心室，這是灌流液的出口。剪開心尖的位置一定要掌握好，不能偏右使灌注針插入右心室。
注意事項：
1. 針頭大小與動物的種類有關(guān)，t同時針頭一定要磨鈍。
2. 檢查灌注泵的運作情況，一定排出管子的氣泡和空氣，防止空氣栓塞
3. 經(jīng)腹腔暴露胸腔，先清楚升主動脈外面的脂肪組織和心外膜組織
4. 將針頭經(jīng)左心室插入升主動脈（顏色變白的哦），并用鉗子固定
5. 解開右心耳，同時開啟灌注泵。注意，不要隨便揭開心臟的其他部位，否則有時候可能會灌注成功但是絕大部分會造成灌注不成功，尤其肺水腫。
6. 將4度的生理鹽水（*好已動物的肝臟發(fā)白為標準，我們實驗室的大鼠約用250ml）和多聚甲醛(根據(jù)所取得材料而定)依次灌入
7. 整個過程均應將動物放在冰上，以便于*大程度的保存目的蛋白和酶的活性
本文整理于丁香園論壇：詳見：http://www.dxy.cn/bbs/topic/13697530