網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2017 － 12 － 14 13: 50    網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / / kns． cnki． net / kcms / detail /34． 1086． Ｒ． 20171211． 1848． 058． html

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

( 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南省中藥粉體與**藥W省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

doi: 10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2018． 01． 029

文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào): 1001 － 1978( 2018) 01 － 0141 － 05

中國(guó)圖書分類號(hào): Ｒ-332; Ｒ322. 81; Ｒ347; Ｒ363-332; Ｒ749. 41;

Ｒ749. 72; Ｒ977. 11

摘要: 目的 探討慢性皮質(zhì)酮注射對(duì)近靈長(zhǎng)類動(dòng)物樹鼩焦慮和抑郁樣行為的影響，并進(jìn)行藥W預(yù)見(jiàn)性評(píng)價(jià)，建立新型焦   慮性抑郁動(dòng)物模型。

方法 12 只中緬樹鼩隨機(jī)分為正常組、模型組和文拉法辛組，每組 4 只。采用慢性皮質(zhì)酮注射( ih，27 mg·kg － 1 ，21 d) 建立焦慮性抑郁樹鼩模型，文拉法辛組于造模同時(shí)灌胃給藥( 6 mg·kg － 1 ) 。采用自主活動(dòng)評(píng)分、糖水偏好測(cè)試、Morris  水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)樹鼩的焦慮和抑郁行為表現(xiàn); ELISA 試劑盒檢測(cè)樹鼩血漿 CＲH、ACTH、COＲ 含量; HPLC-ECD  法檢測(cè)樹鼩腦內(nèi)海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì)的單胺遞質(zhì) 5-HT、NE、DA  含量。

結(jié)果與正常組比較，模型組樹鼩自主活動(dòng)評(píng)分、糖水偏食度、學(xué)習(xí)記憶能力均明顯下  降( P ＜ 0. 01 ) ，血漿 CＲH、ACTH、COＲ 含量明顯上升( P ＜0. 05) ，海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì) 5-HT、NE、DA 含量降低( P＜ 0. 05 ) ; 文拉法辛組樹鼩學(xué)習(xí)記憶能力得到改善，血漿CＲH、COＲ 含量明顯降低( P ＜ 0. 05) ，各腦區(qū) 5-HT、NE、DA 含量上升( P ＜ 0. 05) 。結(jié)論 焦慮性抑郁模型樹鼩具有明顯的 HPA 軸亢進(jìn)及單胺遞質(zhì)失調(diào)現(xiàn)象，而文拉法辛能夠逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象，說(shuō)明該焦慮性抑郁樹鼩模型具有藥W預(yù)見(jiàn)性，是 一種更接近人類臨床的新型焦慮性抑郁動(dòng)物模型。

關(guān)鍵詞: 焦慮; 抑郁; 樹鼩; 文拉法辛; HPA 軸; 單胺遞質(zhì); 皮質(zhì)酮

焦慮性抑郁癥是一種重性抑郁與焦慮共病的復(fù)合型精 神障礙J病，具有精神運(yùn)動(dòng)遲滯、致殘率及自S率高、社會(huì)功 能損害重、預(yù)后差等特征［1］。大量研究表明，焦慮與抑郁的 發(fā)病機(jī)制均涉及到神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)［2］、下丘腦 － 垂體 － 腎上腺( hypothalamic- pituitary- adrena，HPA) 軸紊亂、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)缺乏等［3］，然而，焦慮性抑郁J病的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。本課題組前期已建立焦慮性抑郁大鼠模型［4］，但考慮到該復(fù)合型J病的特殊性以及嚙齒類動(dòng)物與人類親緣關(guān)系的疏遠(yuǎn)性， 采用常規(guī)的嚙齒類動(dòng)物并不能完全滿足該J病的研究，建立一種更能模擬焦慮性抑郁臨床發(fā)病特點(diǎn)的合適模型對(duì)該病的防治尤為重要［5］。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用近靈長(zhǎng)類動(dòng)物樹鼩［6］ 為研究對(duì)象， 通過(guò)慢性皮質(zhì)酮注射建立焦慮性抑郁樹鼩模型，研究焦慮性抑郁模型樹鼩血漿促腎上腺皮質(zhì)J素釋放J素( corticotropin releasing hormone，CＲH) 、皮質(zhì)醇( cortisol，COＲ) 、促腎上腺皮質(zhì)J素( adrenocorticotrophic hormone，ACTH ) 及海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì)的單胺遞質(zhì) 5-羥色胺( 5-hydroxytryptamine，5- HT) 、去甲腎上腺素( norepinephrine，NE) 、多巴胺( dopamine， DA) 含量的表達(dá)情況，并采用臨床**該J病的一線用藥文拉法辛對(duì)模型樹鼩進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)行藥W預(yù)見(jiàn)性研究，確定模型的可行性，為該病的臨床防治及抗焦慮性抑郁新藥的研發(fā)提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1． 1    動(dòng)物    CL 級(jí)中緬樹鼩 12 只，♂，體質(zhì)量 130 ～ 150 g，購(gòu)自云南昆明樹鼩種質(zhì)資源中心，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)**附屬醫(yī)院 SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK( 湘) 2015-0003］。飼養(yǎng)于不銹鋼籠具內(nèi)，室溫( 24 ± 2) ℃ 、相對(duì)濕度( 50 ± 5) % 、光/ 暗周期 12 h /12 h，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3Ｒ 原則給予人道關(guān)懷。

1． 2    試劑與儀器     CＲH、ACTH、COＲT 試劑盒( 美國(guó) Ｒ＆D公司) ; 文拉法辛緩釋片( 成都康弘藥業(yè)) ; 皮質(zhì)酮( 北京索萊寶生物公司) ; 5-HT、NE、DA 對(duì)照品( 中國(guó)藥品生物制品檢定所) 。Morris 水迷宮( 北京智鼠多寶生物科技公司) ; 動(dòng)物行為學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)( 法國(guó) Viewpoint 公司) ; MK-3 型酶標(biāo)儀( 美國(guó) Thermo Scientific 公司) ; 全自動(dòng)勻漿機(jī)( 德國(guó) IKA 公司) ; 1260 型高效液相色譜儀( 美國(guó)安捷倫公司) ; SDC 電化學(xué)檢測(cè)器( 荷蘭 Antec 公司) 。

1． 3    造模及分組    12 只樹鼩隨機(jī)分為 3 組: 正常組、模型組、文拉法辛組，每組 4 只。正常組樹鼩正常飼養(yǎng); 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的樹鼩對(duì)大鼠體表?yè)Q算系數(shù)［7］，模型組樹鼩每天給予皮質(zhì)酮皮下注射( 27 mg·kg － 1 ) ，持續(xù) 21 d; 文拉法辛組樹鼩于造模同時(shí)灌胃給予藥W文拉法辛( 6 mg·kg － 1 ，1 d) ，正常組和模型組給予等體積生理鹽水，造模完成后，進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。測(cè)   試完成后，將動(dòng)物麻醉，腹主動(dòng)脈取血，于冷凍臺(tái)上分離出大   腦海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì)、丘腦等組織，液氮中保存?zhèn)溆?span>。

1． 4    行為學(xué)檢測(cè)

1． 4． 1    自主活動(dòng)評(píng)分    造模結(jié)束后，分析樹鼩的自主活動(dòng)能力，時(shí)間為 5 min。自主活動(dòng)評(píng)分包括移動(dòng)( 水平方向的位移) 和跳躍( 垂直方向的位移) ，將兩者次數(shù)相加表示各組樹鼩的相對(duì)活動(dòng)能力。

1． 4． 2    糖水偏好測(cè)試    各組樹鼩禁水 12  h 后，每籠放置 2個(gè)水盒，一個(gè)裝 100 mL 蔗糖水( 0. 029 mol·L － 1 ) ，另一個(gè)裝等量的蒸餾水，測(cè)定樹鼩在 6 h( 9 ∶ 00 ～ 15 ∶ 00) 內(nèi)分別攝入蔗糖水和蒸餾水的體積，并計(jì)算糖水偏好率( 糖水消耗體積/ 總消耗體積 × 100% ) 。

1． 4． 3    Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)    水槽平均劃分為 A、B、C、D 4 個(gè)象限，用奶粉將水調(diào)成乳白色，將平臺(tái)置于水面下 2  cm，使其在實(shí)驗(yàn)光線下對(duì)樹鼩不可見(jiàn)。于實(shí)驗(yàn) d 17 開始對(duì)樹鼩進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，即從平臺(tái)象限的正對(duì)面將樹鼩面向池壁放入   水中，若 75 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其牽引至平臺(tái)處停留 10 s， 每天訓(xùn)練 1 次，持續(xù)4 d［8］。每次訓(xùn)練結(jié)束后，迅速用毛巾將樹鼩毛發(fā)擦干，以防止樹鼩低體溫。

定位航行實(shí)驗(yàn): 訓(xùn)練完成后，將樹鼩從訓(xùn)練位置面向池壁放入水中，觀察并記錄樹鼩爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期( escape latency，EL) ，考察其學(xué)習(xí)能力。

探索實(shí)驗(yàn): 于實(shí)驗(yàn) d 21 撤除平臺(tái)，由同一入水點(diǎn)將樹鼩面向池壁放入水中，記錄 1 min 內(nèi)樹鼩在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間( stay time，ST) ，考察其記憶能力。

1． 5    HPA 軸指標(biāo)含量測(cè)定    行為學(xué)測(cè)試完成后，用****鈉( 40 mg·kg － 1 ) 將動(dòng)物麻醉，腹主動(dòng)脈取血，收集于肝素鈉管中，3 000 r·min － 1 離心 15 min，取血漿，－ 80℃ 保存。嚴(yán)格按照 ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組樹鼩血漿 CＲH、ACTH、COＲ 的含量。

1． 6    單胺遞質(zhì)含量測(cè)定

1. 6． 1    腦組織勻漿樣本制備    取冷凍保存的海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì)，精密稱重，按 1 ∶ 3 比例( 杏仁核為 1 ∶ 10) 分別

加入 0. 01 mol·L － 1 高氯酸溶液( 內(nèi)含 0. 03 mmol·L － 1 ED-TA，10 μg·L － 1 內(nèi)標(biāo) DHBA) ，于冰上進(jìn)行勻漿，勻漿后 4℃ 、13 000 r·min － 1 離心 10 min ，取上清，用 0. 22 μm 針頭過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)樣。

1． 6． 2    色譜條件      色譜柱: Quattro 3  C18 柱( 150  mm × 2. 1

mm，3 μm) ; 流動(dòng)相: 含 90 mmol·L － 1 單水磷酸二氫鈉、50 mmol·L － 1 單水檸檬酸、1. 7 mmol· L － 1 辛烷磺酸鈉、50 mol

·L － 1 EDTA 的混合液 － 甲醇( 87 ∶ 13 ) ; 流速: 0. 2 mL · min － 1 ; 柱溫: 35℃ ; 進(jìn)樣量: 20 μL。

1． 6． 3    標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制    精密稱取適量 5-HT、NE、DA 對(duì)照品，溶于0. 01 mol·L － 1 高氯酸溶液中，配成 1 g·L － 1 混合儲(chǔ)備液。取適量體積的儲(chǔ)備液稀釋成 5  個(gè)梯度濃度點(diǎn)，從低到高依次為

3. 125、6. 25、12. 5、25、50 μg·L － 1 ，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液由低濃度至高濃度進(jìn)樣，進(jìn)樣體積20 μL，對(duì)色譜峰進(jìn)行積分，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線( Fig 1) 。

7   統(tǒng)計(jì)學(xué)分析   采用 SPSS 17.  0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 x珋± s 表示。組間差異比較采用單因素方差分析， 兩兩比較方差齊時(shí)采用 LSD 檢驗(yàn)法，方差不齊時(shí)采用 Dun- nett＇s T3 法進(jìn)行分析。