厄貝沙坦、阿司匹林單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)MCA鼠模型腦損傷影響的觀察

李春華1，王曉東2，朱予津2，王 正2，嚴(yán)子平2，劉長勝2

（武警天津總隊(duì)醫(yī)院：1.內(nèi)科；2.藥械科，天津  300162）

摘 要：【目的】利用MCAO 模型大鼠研究厄貝沙坦（IRB）、阿司匹林（ASP）在腦卒中后對(duì)腦組織的影響?！痉椒ā啃坌訵istar 大鼠40 只隨機(jī)分為5 組：MCAO，IRB+MCAO，ASP+MCAO，IRB+ASP+MCAO，正常對(duì)照。連續(xù)給藥7 d 后，I-IV 組行MCAO 術(shù)，24 h后觀察行為、梗塞容積、生化指標(biāo)，SPSS16.0 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。【結(jié)果】預(yù)防性給予IRB、ASP 的大鼠與單純MCAO 大鼠比較，自發(fā)活動(dòng)率、抓力、過氧化氫酶水平呈上升趨勢，梗塞容積、TBARS  水平呈下降趨勢（P＜0.05）?！窘Y(jié)論】IRB  與ASP  有改善腦卒中后腦損傷的作用，聯(lián)合用藥效果更為顯著。

關(guān)鍵詞：腦卒中；MCAO 大鼠模型；厄貝沙坦；阿司匹林

【文章編號(hào)】2095-3720(2013)04-0252-04 【中圖分類號(hào)】R965 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

  腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康和生命**的常見的難治性**［1］，存在著明顯三高（發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高）現(xiàn)象，已得過腦卒中的患者，還易再復(fù)發(fā)，每復(fù)發(fā)一次，加重一次。所以，急需采取有效措施預(yù)防腦卒中的發(fā)生。厄貝沙坦（Irbesartan，IRB）為血管緊張素Ⅱ受體抑制劑，能特異性地拮抗血管緊張素轉(zhuǎn)換酶1 受體，抑制血管收縮和醛固酮的釋放，產(chǎn)生降壓作用［2］。阿司匹林（Aspirin，ASP）是一種抗風(fēng)濕歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛、**、抗風(fēng)濕和抗血小板聚集等多方面的藥理作用［3］。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察大鼠的行為、梗塞容積、生化指標(biāo)來了解IRB 與ASP 降低腦卒中后腦損傷的效果，并探討聯(lián)合用藥是否具有事半功倍的療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料

  藥品及試劑：IRB（上海雅吉生物科技有限公司，100 mg），ASP（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，200 mg），0.5%CMC-Na、SDS（任丘市華燕化工產(chǎn)品有限公司）。TBARS 試劑盒（SAT-330），過氧化氫酶試劑盒（SAT-341）購于Cell Biolabs Inc。

1.1.1 儀器：MCAO 線（2636-50，北京沙東生物技術(shù)有限公司），自發(fā)活動(dòng)視頻分析系統(tǒng)和大小鼠抓力測定儀（DB018，DB025，北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司），病理圖像分析儀（DMR+Q550，德國萊卡），酶標(biāo)分析儀（Thermo Scientific Multiskan FC 酶標(biāo) 儀 ，美 國 賽 默 飛 世 爾），轉(zhuǎn) 膜 儀（Bio-rad Trans-Blot，美國伯樂）。

1.1.2 動(dòng)物：健康雄性清潔級(jí)Wistar 大鼠由**科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重250~300 g，籠養(yǎng)，動(dòng)物質(zhì)量合格證書編號(hào)SCXK-（軍）2002-001。

1.2 方 法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥：將大鼠隨機(jī)分為5 組，每組8 只。第 1 組，建立單純右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO) 模型，灌胃0.5%CMC 溶液5 ml；第2 組建立MCAO 模型之前灌胃給予IRB（IRB 按 0.04 g/ml 溶于 0.5% CMC-Na 溶液）5 ml；第3 組，建立MCAO 模型之前灌胃給予ASP（ASP 按0.08 g/ml 溶于0.5% CMC-Na溶液）5 ml；第4組，建立MCAO 模型之前給予IRB+ASP（體積各半） 5 ml；第 5 組為正常對(duì)照組灌胃 0.5% CMC 溶液 5 ml。定時(shí)經(jīng)口腔灌飼液體，1 次/d，連續(xù)7 d。*后一次給藥3 h 后第1~4 組建立MCAO 模型，建模2 h 后恢復(fù)灌注22 h，隨即監(jiān)測自發(fā)活動(dòng)與握力，然后處死大鼠，取出腦組織檢測梗死容積、TBARS、過氧化氫 酶水平。

1.2.2 MCAO模型制備：大鼠麻醉（水合氯醛400 mg/ kg，經(jīng)腹腔注射）后仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，行頸前正中切口分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，再向頭端分離出頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，并分離出頸內(nèi)動(dòng)脈顱外段分支翼腭動(dòng)脈，夾閉其近端。在頸外動(dòng)脈根部剪口，將MCAO 線經(jīng)頸外動(dòng)脈逆向插入頸內(nèi)動(dòng)脈，到達(dá)大腦前動(dòng)脈近端，作為栓塞成功標(biāo)記［4］。

1.2.3 自發(fā)活動(dòng)率和抓力測量：利用自發(fā)活動(dòng)視頻分析系統(tǒng)和大鼠抓力測定儀對(duì)大鼠逐一進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)與抓力測試。

1.2.4  梗塞容積計(jì)算：將大鼠斷頭取腦并速凍后自視交叉向后作厚約2 mm 的連續(xù)切片6 片，置于2％ 氯代三苯基四氮唑（Triphenyltetrazolium chloride，TTC）緩沖液中，37℃避光孵育30 min。采用病理圖像分析儀的軟件分析系統(tǒng)計(jì)算每張冠切片的腦梗塞面積，根據(jù)面積和切片間隔計(jì)算腦片上梗塞灶體積占全腦體積的百分比［4］，見圖1。

1.2.5 硫代***酸活性物質(zhì)分析（Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）：PBS 溶液沖洗新鮮腦組織樣本，低溫下制得組織勻漿。4℃，10 000 r/min 離心 5 min，收集上清。按2：2：5 的比例依次加入樣品、SDS 裂解液、TBA 稀釋液。95℃水浴 50 min，冷卻后3 000 r/min 離心15 min。使用酶標(biāo)分析儀測定532nm 處光吸收度。

1.2.6 過氧化氫酶分析：PBS 溶液沖洗新鮮腦組織， 低溫下制得組織勻漿。4℃ ，10 000 r/min 離心 15 min 收集上清，利用Western Blot 檢測樣品中過氧化氫酶水平，IPWin6.0 軟件分析Western Blot 結(jié)果。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)方法：本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用單因素方差分析和LSD 檢驗(yàn)分析IRB 與ASP 對(duì)MCAO 模型大鼠的影響，應(yīng)用簡單方差分析檢驗(yàn)IRB  與ASP  有無交互效應(yīng)。數(shù)據(jù)以（ ±s）形式表示，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IRB，ASP，IRB+ASP 對(duì)MCAO模型大鼠自發(fā)活動(dòng)率的影響

每只大鼠置于暗室之中通過軟件記錄10 min 中內(nèi)的自發(fā)活動(dòng)次數(shù)。正常大鼠10 min 的自發(fā)活動(dòng)率為（289.88±22.93）次，第1 組大鼠10  min 的自發(fā)活動(dòng)率（22.63±2.83）次嚴(yán)重降低（P＜0.05），而第4組大鼠 10 min 的自發(fā)活動(dòng)率則保持在較高水平（199.75±6.84）次，第 2 組與第 3 組介于二者之間。見表1。

2.2 IRB，ASP，IRB+ASP 對(duì)MCAO 模型大鼠抓力的影響

正常大鼠的抓力約為（0.64±0.12）kg/U，施行 MCAO 手術(shù)后，所有大鼠抓力均有不同程度下降，第4 組大鼠降至（0.39±0.01）kg/U，第2 組與第3 組大鼠則分別（0.23±0.05）、（0.20 ±0.02）kg/U，第 1 組下降*為明顯，僅剩（0.07 ±0.01）kg/U。見表1。

2.2 IRB，ASP，IRB 聯(lián)合ASP 對(duì)MCAO 模型大鼠梗塞容積的影響

第 1 組大鼠的大腦梗塞容積高達(dá)（296.87 ± 24.10）mm3，第 2 組（159.72 ± 15.98）mm3 與第 3 組（164.09±17.64）mm3 則低于第1 組，而第4 組大鼠的梗塞容積*少僅（71.91±13.42）mm3。見表1。

正常大鼠的抓力約為（0.64±0.12）kg/U，施行 MCAO 手術(shù)后，所有大鼠抓力均有不同程度下降，第4 組大鼠降至（0.39±0.01）kg/U，第2 組與第3 組大鼠則分別（0.23±0.05）、（0.20 ±0.02）kg/U，第 1 組下降*為明顯，僅剩（0.07 ±0.01）kg/U。見表1。

2.3 IRB，ASP，IRB 聯(lián)合ASP 對(duì)MCAO 模型大鼠

第 1 組大鼠的大腦梗塞容積高達(dá)（296.87 ± 24.10）mm3，第 2 組（159.72 ± 15.98）mm3 與第 3 組（164.09±17.64）mm3 則低于第1 組，而第4 組大鼠的梗塞容積*少僅（71.91±13.42）mm3。見表1。

2.4 IRB，ASP，IRB + ASP 對(duì) MCAO 模型大鼠TBARS的影響

從檢測的結(jié)果來看，正常大鼠 TBARS 只有（217.19 ± 15.62） nM/g，接 受 MCAO 手術(shù)的大鼠TBARS 水平顯著升高，第 1~4 組統(tǒng)計(jì)結(jié)果依次為（571.15 ± 27.56），（315.42 ± 29.45），（332.13 ±31.94），（257.68±26.80）nM/g。見表1。

2.5 IRB，ASP，IRB+ASP 對(duì)MCAO 模型大鼠過氧化氫酶的影響

正常大鼠的過氧化氫酶水平為（76.12±11.74） mU/mg。 與之比較 ，第 1 組大鼠的過氧化氫酶（29.37±4.07）mU/mg，活性明顯降低（P＜0.05），第4組大鼠過氧化氫酶（63.56±5.82）mU/mg，活性略有下降 ，而 第 2 組（41.56 ± 5.51） mU/mg 與第 3 組（40.09±5.95） mU/mg 過氧化氫酶活性略高于第 1 組。見表1。

2.6  1.1 IRB與ASP 的交互作用

簡單方差分析進(jìn)一步證實(shí)，使用IRB、ASP 的確可以對(duì)大腦起到保護(hù)作用（P＜0.05）。但是IRB 與ASP 之間是否存在交互作用則有待商榷（自發(fā)活動(dòng)率、抓力、梗塞容積，P＞0.05；TBARS、過氧化氫酶， P＜0.05）。見表2。

       3 討 論

隨著**譜的改變，腦卒中已成為成年人功能喪失的主要**之一［5］。由于發(fā)病機(jī)制尚不明確， 所以腦卒中后的**效果并不甚理想［6］。同時(shí)由于該**的**周期長、致病率高、易復(fù)發(fā)，給患者及其家庭造成了沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，腦卒中的預(yù)防顯得尤為必要。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用經(jīng)典的MCAO 模型來模擬腦卒中的發(fā)生，并采集了五項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)來反應(yīng)腦卒中后大腦的損傷情況。其中自發(fā)活動(dòng)率、抓力測試反應(yīng)行為的改變，梗塞容積直觀的反應(yīng)損傷范圍，而TBARS、過氧化氫酶則客觀的反應(yīng)受損腦組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度。

腦卒中對(duì)大腦的影響是明顯的。被試大鼠的自發(fā)活動(dòng)由每10 min（289.88±22.93）銳減到（22.63± 2.83）次，而抓力也由（0.64±0.12）kg/U   直降到（0.07±0.01）kg/U。IRB   與ASP可以部分降低大腦血流中斷后運(yùn)動(dòng)腦組織的損傷，改善這種行為的偏失。通過TTC 染色我們可以直觀的看到行單純MCAO 手術(shù)的大鼠大腦右半球大范圍白化，而提前給予 IRB、ASP 的大鼠損傷范圍則較小，IRB+ASP 組的大鼠損傷面積是所有實(shí)驗(yàn)組中*少的，僅為（71.91 ± 13.42）mm3。TBARS 是反應(yīng)脂質(zhì)過氧化的一個(gè)重要指標(biāo)。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在機(jī)體的新陳代謝過程中起著重要的作用，正常情況下與氧自由基反應(yīng)處于協(xié)調(diào)與動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦這種協(xié)調(diào)與動(dòng)態(tài)平衡產(chǎn)生紊亂與失調(diào)，就會(huì)形成氧自由基連鎖反應(yīng)，損害生物膜及其功能，以致形成細(xì)胞透明性病變、纖維化。過氧化氫是一種代謝過程中產(chǎn)生的廢物，它能夠?qū)C(jī)體造成損害。為了避免這種損害，過氧化氫必須被快速地轉(zhuǎn)化為其他無害或毒性較小的物質(zhì)。而過氧化氫酶就是常常被細(xì)胞用來催化過氧化氫分解的工具。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)TBARS、過氧化氫酶的水平與大腦損傷程度相關(guān)，損傷越大，TBARS 水平越高而過氧化氫酶水平越低。至于IRB 與ASP 是否存在交互作用，目前難以定論，但是有一個(gè)現(xiàn)象值得注意，雖然自發(fā)活動(dòng)率、抓力、梗塞容積三項(xiàng)較為宏觀的指標(biāo)均不支持IRB 與ASP 存在交互作用，但是更為微觀的生化指標(biāo)則提示IRB 與ASP 可以增強(qiáng)彼此的效應(yīng)（表2）；即便是自發(fā)活動(dòng)率、抓力、梗塞容積三項(xiàng)指標(biāo)，其統(tǒng)計(jì)圖中的藍(lán)線與綠線也未完全平行，尤其在是代表抓力與梗塞容積的統(tǒng)計(jì)圖中，兩線相交的趨勢更為明顯。

綜上所述，預(yù)防性給予IRB 與ASP，即便是短期用藥，也能對(duì)大腦起到保護(hù)性作用。降低腦組織的損傷，IRB 聯(lián)合ASP 的作用尤為顯著。多篇文獻(xiàn)報(bào)道服用ASP 可有效預(yù)防腦卒中的發(fā)生［7，8］，長期服用 IRB 與ASP 是否可以并在多大程度上降低腦卒中的發(fā)生值得進(jìn)一步探討。在分析數(shù)據(jù)的過程中我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)給予IRB、ASP 的效果無明顯差異，盡管兩種**的結(jié)構(gòu)及藥理作用大相徑庭，但I(xiàn)RB 與ASP 在預(yù)防腦卒中發(fā)生及降低腦損傷的作用是否別無二致則需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。總之，盡管在腦卒中病因發(fā)病機(jī)理、預(yù)防、**等領(lǐng)域還有許多謎團(tuán)亟待解決，本研究也不失為一次有益的嘗試。