左歸降糖解郁方改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠抑郁樣行為的作用及其機(jī)制
楊 蕙1 ，王宇紅2 ，楊 琴2 ， 凌 佳2 ，李 薇1 ，柳 卓2 ， 孟 盼 2 ，劉 檢 1
( 1． 湖南中醫(yī)藥大學(xué) **附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，長沙 410007;
2． 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南省中藥粉體與****省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，長沙 410007)
摘要: 目的 研究左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠抑郁樣行為的作用及其對細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路調(diào)節(jié)的影響。方法 依次給予 SD 大鼠高脂乳劑灌胃與鏈脲佐菌素尾靜脈注射和慢性不可預(yù)知應(yīng)激的方法，建立糖 尿病并發(fā)抑郁癥動(dòng)物模型。按照體重將大鼠隨機(jī)分為 5 組: 模型組、對照組( 0. 18 g·kg － 1 二甲雙胍 + 1. 8 mg·kg － 1 氟西汀) 、高中低 3 個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組( 左歸降糖解郁方: 20. 52，10. 26，5. 13 g·kg － 1 ) ，給藥體積均為 10 mL·kg － 1 ，連續(xù)給藥 4 周; 另設(shè)正常大鼠為正常組。用開野實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠抑郁行為，用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，用蛋白質(zhì)**印跡法檢測大鼠海馬小鳥苷酸三 磷酸結(jié)合蛋白( Ｒas) 、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1 /2 ( EＲK1 /2 ) 及其磷酸化蛋白p － EＲK1 /2、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白( CＲEB) 及其磷酸化蛋白 p － CＲEB 的表達(dá)。結(jié)果 中藥干預(yù)后，在開野實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)次數(shù): 正常組、模型組和高劑量實(shí)驗(yàn)組分別是( 47. 50 ± 15. 81) ，( 7. 50 ± 5. 24) ，( 21. 88 ± 14. 47) 次，與正常組比較，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 01) ; 與模型組比較，高劑量實(shí)驗(yàn)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 05) 。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中大鼠逃避潛伏期回歸直線方程: 正常組、模型組和高劑量實(shí)驗(yàn)組分別為 y = 66. 88 － 10. 76x，y = 63. 56 － 5. 964x， y = 67. 75 － 9. 51x，與正常組比較，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 05) ，與模型組比較，高劑量實(shí)驗(yàn)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 05) 。這 3 組的探索時(shí)間分別為( 36. 63 ± 13. 39) ，( 22. 25 ± 5. 42) ，( 30. 75 ± 7. 92) s，與正常組比較，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 05) ; 與模型組比較，高劑量實(shí)驗(yàn)組大鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 05 ) 。正常組、模型組和高劑量實(shí)驗(yàn)組的 Ｒas 表達(dá)灰度值分別為0. 70 ± 0. 06，0. 08 ± 0. 03，0. 52 ± 0. 08，這 3 組的 p － EＲK1 / EＲK1 的比值分別為0. 62 ± 0. 10，0. 20 ± 0. 03，0. 41 ± 0. 02，這 3 組的 p － EＲK2 / EＲK2 的比值分別為0. 40 ± 0. 09，0. 29 ± 0. 09，0. 32 ± 0. 10，這 3 組的 p － CＲEB / CＲEB 的比值分別為0. 60 ± 0. 10，0. 10 ± 0. 02，0. 46 ± 0. 08。與正常組比較，模型組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均 P ＜ 0. 01 ) ; 與模型組比較，高劑量實(shí)驗(yàn)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均 P ＜ 0. 01) ; 中低 2 個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組僅 p － CＲEB / CＲEB 比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05) 。結(jié)論 左歸降糖解郁方可能通過有效調(diào)控 EＲK 信號通路、激活 CＲEB，從而改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的抑郁樣行為。
關(guān)鍵詞: 左歸降糖解郁方; 糖尿病并發(fā)抑郁癥; 小鳥苷酸三磷酸結(jié)合蛋白; 細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1 /2; 環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白DOI: 10. 13699 / j. cnki. 1001 － 6821. 2017. 21. 021中圖分類號: Ｒ975 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號: 1001 － 6821( 2017) 21 － 2167 － 04據(jù)統(tǒng)計(jì)，無論是 1 型還是 2 型糖尿病，每 4 人中就有 1 人有明顯的抑郁癥狀［1］。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白( CＲEB) 的表達(dá)與抑郁癥密切相關(guān)。糖尿病大鼠腦內(nèi) CＲEB 及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，且與大鼠的學(xué)習(xí)、記憶損傷呈負(fù)相關(guān)［2］。腦組織中的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶( EＲK1 /2) 信號通路激活，可刺激轉(zhuǎn)錄因子 CＲEB 磷酸化，從而調(diào)控多種蛋白基因的表達(dá) 并影響大鼠的空間記憶能力 。前文［4］研究結(jié)果顯示，左歸降糖解郁方可顯著增加糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( BDNF) 的表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬研究左歸降糖解郁方的抗抑郁作用及其對 Ｒas － EＲK1 /2 － CＲEB 信號通路的調(diào)控作用。
材料與方法
1 材料
動(dòng)物 SPF 級雄性 SD 大鼠，180 ～ 220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物許可證號: SCXK( 湘) 2013 － 0004。藥品與試劑 左歸降糖解郁方( ZJJP: 由黃芪 18g、貫葉連翹 3 g、姜黃 9 g、熟地黃 15 g、山茱萸 12 g、枸杞 12 g、菟絲子 9 g、杜仲 9 g、丹參 12 g、丹皮 6 g、牛膝9 g 組成) ，原材料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)**附屬醫(yī)院藥劑科提供，提取液相當(dāng)于生藥量為 1. 14 g·mL － 1 ; 鹽酸二甲雙胍片，規(guī)格: 每片 0. 25 g，批號: 150123，湖南湘雅制藥有限公司生產(chǎn); 鹽酸氟西汀膠囊( 商品名: 百憂解) ，規(guī)格: 每粒 20 mg，批號: SS41A，購自法國 Patheon公司; 鏈脲佐菌素( STZ) ，規(guī)格: 每支 100mg，批號: 1122F031，購自北京索萊寶公司。小鳥苷酸三磷酸結(jié)合蛋白( Ｒas) 、EＲK1 /2 及其磷酸化蛋白 p － EＲK1 /2、CＲEB 兔抗大鼠多克隆抗體，購自美國 Cell Signaling公司; EＲK1 /2 兔抗大鼠多克隆抗體，購自美國 Proteintech 公司; 兔抗IgG － HＲP，購自北京中杉金橋; Protein ECL 高敏化學(xué)發(fā)光試劑盒，購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。
儀器 Open － field 敞箱，購自美國東樂自然基因生命科學(xué)公司; Morris 水迷宮，購自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司; 電泳儀，購自美國 BIO － ＲAD 公司。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2. 1 建立糖尿病并發(fā)抑郁癥動(dòng)物模型［4］SD 大鼠灌胃給予高脂乳劑 14 d 后，尾靜脈注射STZ 溶液 38 mg· min － 1 。對照組給予等量檸檬酸緩4 ℃ 下、以 1. 2 × 104 r·min － 1 離心 20 min。測定總蛋白含量。按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行操作。磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白均用TBST 洗3 次，每次10 min，用 ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。
3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
數(shù)據(jù)分析采用 SPSS16. 0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x珋± s表示。各指標(biāo)采用單因素方差分析( ANOVA) ，雙側(cè) t 檢驗(yàn)。
結(jié) 果
1 比較幾組大鼠給藥前后的活動(dòng)次數(shù)正常組、模型組、對照組、高中低 3 個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組
大 鼠 的 活 動(dòng) 次 數(shù) 分 別 為 ( 47. 50 ± 15. 81 ) ，( 7. 50 ± 5. 24) ，( 34. 13 ± 21. 96 ) ，( 21. 88 ± 14. 47 ) ，( 16. 13 ± 10. 25 ) ，( 15. 25 ± 14. 02 ) 次。與正常組比較，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＜ 0. 01) ; 與模型組比較 對照組和高劑量實(shí)驗(yàn)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05 ) 。表明二甲雙胍和氟西汀的聯(lián)合用藥以及高劑量左歸降糖解郁方均可顯著改善模型大鼠的抑郁樣行為，增強(qiáng)其自主活動(dòng)興趣，見表 1。
2 比較幾組大鼠給藥前后的認(rèn)知功能
正常組、模型組、對照組、高中低3 個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組大鼠的逃避潛伏期的直線回歸方程如下: y = 66. 88 －10. 76x( Ｒ2 = 0. 77) ，y = 63. 56 － 5. 964x( Ｒ2 = 0. 35) ，y =68. 75 － 10. 25x ( Ｒ2 = 0. 92) ，y = 67. 75 － 9. 51x ( Ｒ2 =0. 80) ，y = 65. 19 － 6. 58x( Ｒ2 = 0. 59) ，y = 64. 69 － 5. 78x( Ｒ2 = 0. 51) 。與正常組比較，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 05) 。與模型組比較，對照組和高劑量實(shí)驗(yàn)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均 P ＜ 0. 05) ，見表 2。給藥后第 5 天，正常組、模型組、對照組、高中低 3 個(gè) 劑 量 實(shí) 驗(yàn) 組 大 鼠 的 探 索 時(shí) 間 分 別 為( 36. 63 ± 13. 39) ，( 22. 25 ± 5. 42) ，( 31. 25 ± 10. 25 ) ，( 30. 75 ± 7. 92) ，( 28. 00 ± 10. 14) ，( 27. 63 ± 7. 09) s。與正常組比較，模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 05) 。與模型組比較，對照組和高劑量實(shí)驗(yàn)組差異均有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義( 均 P ＜ 0. 05) ，見表 2。
3 比較幾組大鼠給藥前后 Ｒas 信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的變化**干預(yù)后，Ｒas 在大鼠海馬中表達(dá)的灰度值: 正常組、模型組、對照組、高中低 3 個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組分別為0. 70 ± 0. 06，0. 08 ± 0. 03，0. 59 ± 0. 03，0. 52 ± 0. 08，0. 16 ± 0. 05，0. 11 ± 0. 05; p － EＲK1 / EＲK1 在大鼠海馬中的灰度值比: 這 6 組分別為 0. 62 ± 0. 10， 0. 20 ± 0. 03，0. 56 ± 0. 12，0. 41 ± 0. 02，0. 21 ± 0. 03，0. 19 ± 0. 05; p － EＲK2 / EＲK2: 這 6 組 分 別 為0. 40 ± 0. 09，0. 29 ± 0. 09，0. 39 ± 0. 02，0. 32 ± 0. 10，0. 30 ± 0. 07，0. 27 ± 0. 05; p － CＲEB / CＲEB 表達(dá): 這 6組分別為 0. 60 ± 0. 10，0. 10 ± 0. 02，0. 56 ± 0. 08，0. 46 ± 0. 08，0. 44 ± 0. 06，0. 33 ± 0. 11。與正常組比較，模型組的 Ｒas 表達(dá)、p － EＲK1 / EＲK1 和 p － CＲEB / CＲEB 比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均 P ＜ 0. 01) 。與模型組比較，對照組和高劑量實(shí)驗(yàn)組的 Ｒas 表達(dá)、p － EＲK1 / EＲK1 和 p － CＲEB / CＲEB 比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均 P ＜ 0. 01) ; 中低 2 個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組僅 p － CＲEB / CＲEB 比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05) 。結(jié)果提示，西藥聯(lián)合用藥和左歸降糖解郁方高劑量均可有效調(diào)節(jié)模型大鼠海馬內(nèi) Ｒas 信號通路，表略。
討 論
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，予左歸降糖解郁方對 CＲEB 的磷酸化水平調(diào)節(jié)作用較為明顯。由此推測，左歸降糖解郁方改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的抑郁樣行為和認(rèn)知行為，可能與其有效調(diào)節(jié)大鼠海馬 CＲEB 磷酸化水平密切相關(guān)。BDNF 基因的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)含有 CＲE 序列，可接受 CＲEB 的調(diào)控［6-7］，因此推測，左歸降糖解郁方對海馬神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用可能也與其調(diào)控CＲEB 磷酸化水平有關(guān)。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)抑郁癥模型的大鼠海馬 Ｒas 表達(dá)顯著減少，p － EＲK1 / EＲK1 比例下降;而給予左歸降糖解郁方后，Ｒas 表達(dá)增多，p － EＲK1 / EＲK1 比例上調(diào)顯著。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，左歸降糖解郁方可顯著改善糖 尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的抑郁樣行為和學(xué)習(xí)認(rèn)知能力， 其抗抑郁作用可能與其調(diào)節(jié)大鼠海馬 CＲEB 相關(guān)信號通路有關(guān)。