塞來昔布聯(lián)合吉西他濱動(dòng)脈灌注抑制人肺癌 A549 細(xì)胞移植瘤的研究

何 陽，趙保成，劉洪強(qiáng)，王賽博，鄭曉輝，曹 軍

( 上海市徐匯區(qū)大華醫(yī)院，上海 200237)

［ 摘要］  目的  研究塞來昔布聯(lián)合吉西他濱經(jīng)動(dòng)脈灌注抑制人肺癌 A549 細(xì)胞移植瘤的作用。方法  人肺癌 A549 細(xì)胞系經(jīng)傳代培養(yǎng)后，移植于 40 只祼大鼠建立肺癌裸大鼠模型。將荷瘤鼠均分為假手術(shù)組、吉西他濱組、塞來昔布組、聯(lián)合組。假手術(shù)組動(dòng)脈注入生理鹽水 0． 2 mL。吉西他濱組、塞來昔布組分別經(jīng)動(dòng)脈灌注吉西他濱 100 mg / kg 及塞來昔布 25 mg / kg。聯(lián)合組灌注吉西他濱 100 mg / kg + 塞來昔布 25 mg / kg。觀察干預(yù)前后各組大鼠腫瘤體積的變化，計(jì)算荷瘤鼠的抑瘤率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率，采用 Western blot 法檢測各組Bcl － 2 以及 Caspase － 3 表達(dá)情況。結(jié)果 吉西他濱組、塞來昔布組和聯(lián)合組的抑瘤率分別為 54． 18% ，49． 52% 和 88． 59% ; 聯(lián)合組移植瘤組織的 Bcl － 2 表達(dá)量均低于其他 3 組( P 均 ＜0． 05) ，Caspase － 3 表達(dá)量及凋亡指數(shù)均高于其他 3 組( P 均 ＜ 0． 05) 。結(jié)論    塞來昔布與吉西他濱動(dòng)脈灌注都能抑制肺癌裸大鼠移植瘤的生長，二者聯(lián)合應(yīng)用效果更好，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是兩者協(xié)同抗腫瘤作用的機(jī)制。

［關(guān)鍵詞］ 塞來昔布; 吉西他濱; 動(dòng)脈灌注化療; 肺癌doi: 10． 3969 / j． issn． 1008 － 8849． 2015． 32． 003

［中圖分類號(hào)］  Ｒ － 332 ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］   A ［文章編號(hào)］ 1008 － 8849( 2015) 32 － 3542 － 04

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，肺癌患者 5 年的生存率僅為 16． 1% ，在癌癥死亡患者中肺癌是男性**死亡因素，是女性第三死亡因素，因此積極探尋有效的**方式成為研究重點(diǎn)［1］。環(huán)氧合酶 － 2 ( COX － 2) 不僅能夠促進(jìn)腫瘤血管和**管形成，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，而且對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生 長、轉(zhuǎn)移及將前致癌物質(zhì)轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)有主導(dǎo)作用。動(dòng)物 試驗(yàn)表明，選擇性 COX － 2 抑制劑塞來昔布灌胃可抑制裸鼠移植瘤的生長［2］。還有試驗(yàn)報(bào)道，第三代化療藥吉西他濱應(yīng) 用于中晚期肺癌的介入化療中，不僅能夠直接殺滅惡性腫瘤 細(xì)胞，同時(shí)可抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮間接抗腫瘤作用，且近 期有效率高于第三代靜脈化療方案［3］。但是關(guān)于塞來昔布聯(lián)合吉西他濱動(dòng)脈灌注抑制人肺癌 A549 細(xì)胞移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究尚少見，為此筆者以體外實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了研究，旨在為今 后從分子角度采用此種方式**肺癌奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1. 1   材料    人肺癌 A549( 上海市腫瘤研究所) 。SPF 級(jí)裸大鼠 40 只、BALB / C 裸小鼠 4 只( 北京智鼠多寶公司) ，動(dòng)物合格證 SYXK( 滬) 2007 － 0001，裸大鼠體質(zhì)量( 180 ± 15) g，8 ～ 10 周齡，雌雄各半; 裸小鼠體質(zhì)量( 22． 1 ± 2． 1) g，4 ～ 5 周齡，雌雄各半。飼養(yǎng)相對(duì)濕度 40% ～ 50% ，溫度 22 ～ 25 ℃ ，攝食、飲水自由同等。塞來昔布(  輝瑞公司) ，吉西他濱(  豪森藥業(yè)) 。Annexin V － FITC / PI 凋亡試劑盒( 上海炎彬化工科技有限公司) ; ECL 試劑盒( BestBIO 公司) ，半胱氨酸蛋白 酶( Caspase)  － 3，B **細(xì)胞瘤( Bcl)  － 2，GAPDH  抗體( Santa cruz) ，鼠抗人二抗( 碧云天) 。

1. 2 方 法

1. 2. 1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人肺癌 A549 細(xì)胞復(fù)蘇，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，取生長良好的細(xì)胞用 0． 25% 胰蛋白酶消化、離心，收集細(xì)胞用 1 mL 冰 PBS 稀釋成 5 × 106 mL － 1 ，以 0． 2 mL 接種于 4 只 BALB / C 裸小鼠右腋皮下( 因?yàn)槁阈∈蠼臃N成瘤容易，直接用肺癌細(xì)胞株接種裸大鼠成瘤困 難，所以先接種裸小鼠，取得足夠量腫瘤組織)  ，待腫瘤長至體積約為10 mm × 10 mm × 10 mm 時(shí)移植于裸大鼠耳后造模。

1. 2. 2    造模分組    將瘤結(jié)無破潰、生長良好的腋下接種荷瘤裸小鼠 4 只處死，無菌條件下剝離瘤結(jié)，**壞死組織，在生理鹽水中將瘤結(jié)反復(fù)剪切為 2 mm × 2 mm × 2 mm 大小的瘤組織塊，然后接種于裸大鼠右耳后皮下。腫瘤于 8 d 后接種成功，腫瘤生長 3 周后體積 2 650 ～ 2 800 mm3 ，對(duì)荷瘤裸大鼠根據(jù)性別分層后分為假手術(shù)組、吉西他濱組、塞來昔布組、聯(lián)合 組，每組 10 只。

1. 2. 3    給**法    用 10% 水合氯醛 3． 5 g / kg 腹腔麻醉各組荷瘤大鼠，頸部正中皮膚切開，暴露右頸動(dòng)脈; 采用改良Seldinger 技術(shù)將靜脈留置針插入右頸動(dòng)脈，先在 C 臂機(jī) DSA 下使用稀釋的碘克沙醇 0． 2 mL 行手推動(dòng)脈造影，診斷腫瘤的供血?jiǎng)用}并明確腫瘤的顯影情況; 再經(jīng)導(dǎo)管灌注**或鹽水， 緩慢推注，灌注時(shí)間 30 s，隨后縫合皮膚。假手術(shù)組經(jīng)導(dǎo)管注入生理鹽水 0． 2 mL，吉西他濱組予吉西他濱 100 mg / kg 導(dǎo)管灌注，塞來昔布組予塞來昔布 25 mg / kg 導(dǎo)管灌注，聯(lián)合組予吉西他濱 100 mg / kg、塞來昔布 25 mg / kg 導(dǎo)管灌注。

1. 2. 4     腫瘤體積及抑瘤率測量方法     采用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長短徑，腫瘤體積( mm3 )  = 腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2 /2。用藥后第16 天處死各組大鼠，取出皮下腫瘤稱質(zhì)量，抑瘤率  = ( 1 － **組瘤質(zhì)量/ 荷瘤假手術(shù)組瘤質(zhì)量)  × 100% 。計(jì)算 Q 值并判斷兩藥的聯(lián)合效應(yīng)［4］: 若 E( A + B) 設(shè)為兩藥聯(lián)用抑瘤率， EA 和EB 為各單藥抑瘤率，則 Q = E( A + B) /［EA + ( 1 － EA) × EB］，Q 值 0． 85 ～ 1． 15 提示兩藥作用相加，Q ＞ 1． 15 提示兩藥協(xié)同，Q ＜ 0． 85 提示兩藥拮抗。

1. 2. 5 組織檢測 取新鮮瘤組織，用 10% 甲醛溶液固定后， 將腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液，離心去除細(xì)胞碎片，收集細(xì)胞

( 每組至少1 × 106 個(gè)細(xì)胞) ，按 Annexin V － FITC / PI 凋亡試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測移植瘤細(xì)胞凋亡率。蘇木素  － 伊紅( HE) 染色檢測各組腫瘤細(xì)胞形態(tài); Western blot 法檢測Bcl － 2 和 Caspase － 3 表達(dá)水平: SDS － PAGE 分離膠電泳; 4% SDS － PAGE  濃縮膠電泳。PVDF  膜半干轉(zhuǎn) 100  V，30  min。 5% 脫脂奶粉封閉過夜。一抗 1 ∶ 1 000 過夜，二抗 1 ∶ 5 000 孵育 1 h。按操作試劑盒說明操作。

1. 3    統(tǒng)計(jì)學(xué)方法    數(shù)據(jù)處理使用 SPSS 13． 0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以 x珋± s 表示，組間比較采用 t 檢驗(yàn)，P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 裸大鼠情況  40 只裸大鼠實(shí)驗(yàn)完成時(shí)均存活，飲水、進(jìn)食、活動(dòng)狀態(tài)良好，各組手術(shù)切口**好，均未見感染。

2. 2 各組荷瘤鼠腫瘤體積比較 各組移植瘤**前體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 均 ＞ 0． 05) 。**后，吉西他濱組、塞來昔布組、聯(lián)合組腫瘤體積均小于假手術(shù)組( P 均 ＜ 0． 05) ，吉西他濱組腫瘤體積小于塞來昔布組( P 均 ＜ 0． 05) ，聯(lián)合組小于吉西他濱組和塞來昔布組( P 均 ＜ 0． 05) 。見表 1。

 2. 3 各組移植瘤質(zhì)量及抑瘤率比較 吉西他濱組、塞來昔布組、聯(lián)合組移植瘤質(zhì)量均明顯低于假手術(shù)組( P 均 ＜ 0． 05 ) ，聯(lián)合組明顯低于吉西他濱組、塞來昔布組( P 均 ＜ 0． 05) ; 聯(lián)合組抑瘤率明顯高于吉西他濱組、塞來昔布組，其 Q 值 ＞ 1． 15。見表 2。

2. 4   各組 Bcl － 2 和 Caspase － 3 蛋白表達(dá)情況 假手術(shù)組Bcl － 2 蛋白相對(duì)表達(dá)量為 1． 20 ± 0． 09，吉西他濱組為 0． 67 ± 0． 15，塞來昔布組為 0． 80 ± 0． 07，聯(lián)合組為 0． 26 ± 0． 08，聯(lián)合組 Bcl － 2 表達(dá)量明顯低于其余 3 組( P 均 ＜ 0． 05) ，吉西他濱組及塞來昔布組明顯低于假手術(shù)組( P 均 ＜ 0． 05) 。假手術(shù)組 Caspase － 3 蛋白相對(duì)表達(dá)量為 0． 53 ± 0． 05，吉西他濱組為 0 . 99 ± 0 ． 06 ，塞來昔布組為0 ． 87 ± 0 ． 03 ，聯(lián)合組為1 ． 46 ±0. 18，吉西他濱組及塞來昔布組 Caspase － 3 蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組( P 均 ＜ 0． 05) ，聯(lián)合組 Caspase － 3 蛋白表達(dá)量明顯高于其余 3 組( P 均 ＜ 0． 05) 。

 2. 5 各組腫瘤組織 HE 染色表現(xiàn)  假手術(shù)組未見明顯細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，見圖 1; 吉西他濱組可見凋亡細(xì)胞致密濃縮核染色質(zhì)，凋亡小體形成，核碎裂，可見較多空泡，見圖 2; 塞來昔布組可見相應(yīng)的凋亡表現(xiàn)，見圖 3; 聯(lián)合組上述核碎裂及空泡更加明顯，見圖 4。